Исследование экспрессии генов АВС-транспортеров в нормальной и опухолевой ткани у больных немелкоклеточным раком легкого в процессе неоадъювантной химиотерапии
|
Перечень условных обозначений, сокращений 3
Реферат 4
Введение 5
Глава 1. Литературный обзор 8
1.1 Рак легкого 8
1.1.1 Классификация рака легких 9
1.1.2 Клинико-анатомическая классификация 9
1.1.3 Гистологическая классификация опухолей легких 10
1.2 Способы лечения НМРЛ 11
1.2.1 Хирургическое лечение НМРЛ 11
1.2.2 Неоадъювантная химиотерапия 11
1.2.3 Адъювантная химиотерапия (послеоперационная химиотерапия) 12
1.3 Химиорезистентность при НМРЛ 14
1.3.1 АВС - транспортеры 15
Глава 2. Материал и методы 22
2.1 Материал для исследования 23
2.2 Методы 23
Глава 3. Результаты и обсуждение 28
3.1 Оценка уровня экспрессии исследуемых генов ABC-транспортеров 28
3.2 Связь экспрессии генов ABC-транспортеров с эффективностью НХТ 33
3.3 Оценка прогностической значимости экспрессии генов ABC-транспортеров 34
3.4 Оценка предиктивной и прогностической значимости изменения экспрессии генов ABC-транспортеров у больных немелкоклеточным раком легкого 36
Реферат 4
Введение 5
Глава 1. Литературный обзор 8
1.1 Рак легкого 8
1.1.1 Классификация рака легких 9
1.1.2 Клинико-анатомическая классификация 9
1.1.3 Гистологическая классификация опухолей легких 10
1.2 Способы лечения НМРЛ 11
1.2.1 Хирургическое лечение НМРЛ 11
1.2.2 Неоадъювантная химиотерапия 11
1.2.3 Адъювантная химиотерапия (послеоперационная химиотерапия) 12
1.3 Химиорезистентность при НМРЛ 14
1.3.1 АВС - транспортеры 15
Глава 2. Материал и методы 22
2.1 Материал для исследования 23
2.2 Методы 23
Глава 3. Результаты и обсуждение 28
3.1 Оценка уровня экспрессии исследуемых генов ABC-транспортеров 28
3.2 Связь экспрессии генов ABC-транспортеров с эффективностью НХТ 33
3.3 Оценка прогностической значимости экспрессии генов ABC-транспортеров 34
3.4 Оценка предиктивной и прогностической значимости изменения экспрессии генов ABC-транспортеров у больных немелкоклеточным раком легкого 36
На сегодняшний день, онкопатология легких по-прежнему является наиболее распространенной причиной смертности от рака во всем мире (Фоменко А. В., 2018). Немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) составляет около 85% всех случаев рака легкого (РЛ). Местно-распространенная форма или III стадия болезни встречается у 30% пациентов с НМРЛ (Колбанов К., 2016). Лечение III стадии остается сложной и
противоречивой задачей, что большей частью связано с разными степенями распространенности первичной опухоли. Условная радикальность хирургического вмешательства при III стадии НМРЛ обусловлена высокой вероятностью наличия субклинических метастазов, поэтому в лечении данной категории больных требуется использование системной химиотерапии (Kastelijn E. A., 2019). Список основных
конвенциональных химиопрепаратов, которые в настоящее время чаще всего используются для лечения НМРЛ, достаточно ограничен и включает в себя препараты платины, доксорубицин, этопозид, винорелбин, таксаны, гемцитабин, и т.д. Обычно используются платиносодержащие дублеты с другим цитостатиком из представленного списка (Тюляндин С., 2010). Тем не менее, не смотря на огромные усилия, направленные на разработку новых схем химиотерапии, терапевтические результаты остаются неудовлетворительными (Schiller J. H., 2002). Так установлено, что эффективность
применяемой неоадъювантной (предоперационной) химиотерапии (НХТ) у больных немелкоклеточным раком легкого сильно варьирует (Felip E., 2010; Pisters K. M., 2010; Scagliotti G. V., 2011). Так в работе Pisters K. et al. (Pisters K., 1993) авторы сообщили о 12% больных, которые достигли полного ответа (9 из 73 случаев), Roth J.A. et al. (Roth J. A., 1994) показали отсутствие эффективности НХТ у 28 пациентов, в исследовании Rosell R. et al. (Rosell R., 1994) всего у 3% (1 из 30) пациентов наблюдался положительный ответ на лечение. В целом, средний показатель полного патологического ответа, описанный в исследованиях, составляет всего 4% (диапазон 0-16%).
С точки зрения прогноза, местнораспространенный рак разделяют на IIIA стадию с 24%-й 5-летней выживаемостью и IIIB стадию с неблагоприятным прогнозом и 9%-й 5-летней выживаемостью (Crino L., 2010). Несмотря на постоянное совершенствование хирургического метода, а также применения различных комбинаций адъювантной (послеоперационной) химиотерапии (АХТ), заметной тенденции к улучшению данных выживаемости не наблюдается. У подавляющего большинства больных с III стадией (35-50%) прогрессирование процесса происходит за счет развития отдаленных метастазов (Трахтенберг А. Х., 2008; Crino L., 2010). Эффективность лекарственной терапии
опухолей может быть обусловлена совокупностью целого ряда групп факторов, включающих: основные клинико-морфологические параметры опухолевого процесса; генетические особенности организма, связанные с нормальной генетической изменчивостью генов, вовлеченных в регуляцию жизнедеятельности организма и опухоли и метаболизм лекарственных средств; физиологические особенности организма, которые определяют фон развития и прогрессии опухоли; молекулярно-генетические особенности опухоли, связанные с изменениями (мутации, гипо- и гиперметилирование, амплификация и др.) в онкогенах, в генах-супрессорах и генах-модификаторах, а также с изменениями в паттерне экспрессии многочисленных генов метаболических путей активации лекарственных средств, транспортных генов, генов ферментных систем инактивации ксенобиотиков и т.п. (Olaussen K. A., 2006; Hansen H. H., 2008).
Считается, что основной причиной неэффективности химиотерапии опухоли является формирование под действием лекарственных средств фенотипа адаптивной множественной лекарственной устойчивости (МЛУ), который обусловлен повышением экспрессии генов АВС-транспортеров выбрасывающих широкий спектр химиопрепаратов из опухолевых клеток против градиента концентрации с затратой энергии АТФ (Gottesman M. M., 2002; Gillet J.-P., 2011). Семейство ABC-транспортеров (ATP-Binding Cassette), насчитывает около 50 представителей и наиболее известные из них: ABCB1, ABCB3, ABCC1, ABCC2, ABCC5, ABCG1 и ABCG2. Роль этих генов в развитии МЛУ была доказана в опытах по их трансфекции в чувствительные к цитостатикам линии клеток и в экспериментах in vitro (Raghu G., 1996; Szakacs G., 2008; Szakacs G., 2009). Было установлено, что АВС-транспортеры определяют около 70-85% случаев низкой эффективности конвенциональной химиотерапии (Robey R. W., 2018). В частности было отмечено, что гиперэкспрессия в опухолевой ткани легкого генов АВСВ1, АВСС1 и др. до лечения была связана не только с плохим ответом на неоадъювантную химиотерапию, а также с низкими показателями безметастатической и общей выживаемости (Cuffe S., 2012; Seeree P., 2019).
Таким образом, на сегодняшний день, актуальным является исследование фундаментальных аспектов формирования фенотипа МЛУ у больных РЛ, молекулярно-генетических маркеров химиорезистентности опухолевых клеток, связь с эффективностью химиотерапии. На основании этого перспективным направлением может рассматриваться разработка новых предиктивных и прогностических критериев для максимальной персонализации химиотерапии, которые будут учитывать индивидуальные особенности организма больного и опухоли в соответствии с принципами молекулярной онкологии и фармакогеномики.
Цель дипломной работы: исследование экспрессии генов АВС-транспортеров в нормальной и опухолевой ткани у больных немелкоклеточным раком легкого.
Задачи исследования:
1. Оценить уровень экспрессии исследуемых генов ABC-транспортеров в биопсийном и операционном материале нормальной и опухолевой ткани легкого.
2. Провести анализ связи экспрессии генов АВС-транспортеров с основными клинико-патологическими параметрами пациентов.
3. Провести анализ связи экспрессии генов АВС-транспортеров с эффективностью неоадъювантной химиотерапии.
4. Оценить прогностическую значимость экспрессии генов ABC-транспортеров у больных немелкоклеточным раком легкого.
противоречивой задачей, что большей частью связано с разными степенями распространенности первичной опухоли. Условная радикальность хирургического вмешательства при III стадии НМРЛ обусловлена высокой вероятностью наличия субклинических метастазов, поэтому в лечении данной категории больных требуется использование системной химиотерапии (Kastelijn E. A., 2019). Список основных
конвенциональных химиопрепаратов, которые в настоящее время чаще всего используются для лечения НМРЛ, достаточно ограничен и включает в себя препараты платины, доксорубицин, этопозид, винорелбин, таксаны, гемцитабин, и т.д. Обычно используются платиносодержащие дублеты с другим цитостатиком из представленного списка (Тюляндин С., 2010). Тем не менее, не смотря на огромные усилия, направленные на разработку новых схем химиотерапии, терапевтические результаты остаются неудовлетворительными (Schiller J. H., 2002). Так установлено, что эффективность
применяемой неоадъювантной (предоперационной) химиотерапии (НХТ) у больных немелкоклеточным раком легкого сильно варьирует (Felip E., 2010; Pisters K. M., 2010; Scagliotti G. V., 2011). Так в работе Pisters K. et al. (Pisters K., 1993) авторы сообщили о 12% больных, которые достигли полного ответа (9 из 73 случаев), Roth J.A. et al. (Roth J. A., 1994) показали отсутствие эффективности НХТ у 28 пациентов, в исследовании Rosell R. et al. (Rosell R., 1994) всего у 3% (1 из 30) пациентов наблюдался положительный ответ на лечение. В целом, средний показатель полного патологического ответа, описанный в исследованиях, составляет всего 4% (диапазон 0-16%).
С точки зрения прогноза, местнораспространенный рак разделяют на IIIA стадию с 24%-й 5-летней выживаемостью и IIIB стадию с неблагоприятным прогнозом и 9%-й 5-летней выживаемостью (Crino L., 2010). Несмотря на постоянное совершенствование хирургического метода, а также применения различных комбинаций адъювантной (послеоперационной) химиотерапии (АХТ), заметной тенденции к улучшению данных выживаемости не наблюдается. У подавляющего большинства больных с III стадией (35-50%) прогрессирование процесса происходит за счет развития отдаленных метастазов (Трахтенберг А. Х., 2008; Crino L., 2010). Эффективность лекарственной терапии
опухолей может быть обусловлена совокупностью целого ряда групп факторов, включающих: основные клинико-морфологические параметры опухолевого процесса; генетические особенности организма, связанные с нормальной генетической изменчивостью генов, вовлеченных в регуляцию жизнедеятельности организма и опухоли и метаболизм лекарственных средств; физиологические особенности организма, которые определяют фон развития и прогрессии опухоли; молекулярно-генетические особенности опухоли, связанные с изменениями (мутации, гипо- и гиперметилирование, амплификация и др.) в онкогенах, в генах-супрессорах и генах-модификаторах, а также с изменениями в паттерне экспрессии многочисленных генов метаболических путей активации лекарственных средств, транспортных генов, генов ферментных систем инактивации ксенобиотиков и т.п. (Olaussen K. A., 2006; Hansen H. H., 2008).
Считается, что основной причиной неэффективности химиотерапии опухоли является формирование под действием лекарственных средств фенотипа адаптивной множественной лекарственной устойчивости (МЛУ), который обусловлен повышением экспрессии генов АВС-транспортеров выбрасывающих широкий спектр химиопрепаратов из опухолевых клеток против градиента концентрации с затратой энергии АТФ (Gottesman M. M., 2002; Gillet J.-P., 2011). Семейство ABC-транспортеров (ATP-Binding Cassette), насчитывает около 50 представителей и наиболее известные из них: ABCB1, ABCB3, ABCC1, ABCC2, ABCC5, ABCG1 и ABCG2. Роль этих генов в развитии МЛУ была доказана в опытах по их трансфекции в чувствительные к цитостатикам линии клеток и в экспериментах in vitro (Raghu G., 1996; Szakacs G., 2008; Szakacs G., 2009). Было установлено, что АВС-транспортеры определяют около 70-85% случаев низкой эффективности конвенциональной химиотерапии (Robey R. W., 2018). В частности было отмечено, что гиперэкспрессия в опухолевой ткани легкого генов АВСВ1, АВСС1 и др. до лечения была связана не только с плохим ответом на неоадъювантную химиотерапию, а также с низкими показателями безметастатической и общей выживаемости (Cuffe S., 2012; Seeree P., 2019).
Таким образом, на сегодняшний день, актуальным является исследование фундаментальных аспектов формирования фенотипа МЛУ у больных РЛ, молекулярно-генетических маркеров химиорезистентности опухолевых клеток, связь с эффективностью химиотерапии. На основании этого перспективным направлением может рассматриваться разработка новых предиктивных и прогностических критериев для максимальной персонализации химиотерапии, которые будут учитывать индивидуальные особенности организма больного и опухоли в соответствии с принципами молекулярной онкологии и фармакогеномики.
Цель дипломной работы: исследование экспрессии генов АВС-транспортеров в нормальной и опухолевой ткани у больных немелкоклеточным раком легкого.
Задачи исследования:
1. Оценить уровень экспрессии исследуемых генов ABC-транспортеров в биопсийном и операционном материале нормальной и опухолевой ткани легкого.
2. Провести анализ связи экспрессии генов АВС-транспортеров с основными клинико-патологическими параметрами пациентов.
3. Провести анализ связи экспрессии генов АВС-транспортеров с эффективностью неоадъювантной химиотерапии.
4. Оценить прогностическую значимость экспрессии генов ABC-транспортеров у больных немелкоклеточным раком легкого.
1. Провели сравнение экспрессии генов ABC-транспортеров в биопсийном и операционном материале опухоли легкого, а так же в материале нормальной ткани бронхов.
2. Уровень экспрессии генов ABC-транспортеров слабо связан с основными клинико - морфологическими параметрами пациентов. Установлена только связь с возрастом для гена ABCG2 в биопсийном материале, с размером опухоли для гена ABCC5 в операционном материале, с лимфогенным метастазированием для гена ABCB1 в биопсийном материале и с гистологическим типом опухоли для генов ABCB1 и ABCC2 в операционном материале.
3. Начальный уровень экспрессии генов ABC-транспортеров до лечения никак не влияет на эффект неоадъювантной химиотерапии. Оценка уровня экспрессии генов МЛУ после проведения НХТ в опухолевой ткани у больных с частичной регрессией и стабилизацией не показала статистически значимых различий.
4. Установлено, что при гипоэкспрессии генов ABCB1, ABCG1, ABCG2 после проведения лечения показатель безметастатической выживаемости выше, чем при гиперэкспресии (p=0,003, p=0,001, p=0,03, соответственно).
5. При оценке предиктивной и прогностической значимости изменения экспрессии генов ABC-транспортеров у больных немелкоклеточным раком легкого было установлено, что изменение экспрессии ABCB1 сопряжено c эффектом неоадъювантной химиотерапии. Снижение уровня экспрессии ABCB1 в 71% случаев связан с положительным ответом на химиотерапию (p=0,0007) и более высокими показателями безметастатической выживаемости (log rank test p=0,0001).
2. Уровень экспрессии генов ABC-транспортеров слабо связан с основными клинико - морфологическими параметрами пациентов. Установлена только связь с возрастом для гена ABCG2 в биопсийном материале, с размером опухоли для гена ABCC5 в операционном материале, с лимфогенным метастазированием для гена ABCB1 в биопсийном материале и с гистологическим типом опухоли для генов ABCB1 и ABCC2 в операционном материале.
3. Начальный уровень экспрессии генов ABC-транспортеров до лечения никак не влияет на эффект неоадъювантной химиотерапии. Оценка уровня экспрессии генов МЛУ после проведения НХТ в опухолевой ткани у больных с частичной регрессией и стабилизацией не показала статистически значимых различий.
4. Установлено, что при гипоэкспрессии генов ABCB1, ABCG1, ABCG2 после проведения лечения показатель безметастатической выживаемости выше, чем при гиперэкспресии (p=0,003, p=0,001, p=0,03, соответственно).
5. При оценке предиктивной и прогностической значимости изменения экспрессии генов ABC-транспортеров у больных немелкоклеточным раком легкого было установлено, что изменение экспрессии ABCB1 сопряжено c эффектом неоадъювантной химиотерапии. Снижение уровня экспрессии ABCB1 в 71% случаев связан с положительным ответом на химиотерапию (p=0,0007) и более высокими показателями безметастатической выживаемости (log rank test p=0,0001).
