Аннотация 2
СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ 3
ВВЕДЕНИЕ 4
1 Литературный обзор 6
1.1 Структурная вариабельность генома человека 6
1.1.1 Вариации числа копий участков ДНК 7
1.1.2 Короткие тандемные повторы, простые повторы последовательностей 9
1.1.3 Короткие диспергированные ДНК повторы 10
1.1.4 Роль Alu-элементов в формировании структурной вариабельности генома 11
1.2 Семейство гуанилат-связывающих белков 13
1.2.1 Взаимодействие иммуно-воспалительной системы человека с гуанилат-
связывающими белками 14
1.2.2 Экспрессия белков семейства гуанилат-связывающих белков в тканях
организма человека 15
1.2.3 Противовирусная активность гуанилат-связывающих белков 17
2 Материалы и методы 20
2.1 Дизайн исследования 20
2.2 Формирование выборок 20
2.3 Выделение ДНК из биологических образцов 22
2.3.1 Оценка качества и концентрации выделенных образцов 23
2.4 Дизайн праймеров 24
2.4.1 Градиентная ПЦР 24
2.5 Проведение мультиплексной ПЦР. 25
2.6 ПЦР длинных фрагментов 26
2.7 Вложенная ПЦР 26
2.8 Электрофорез 27
2.9 Секвенирование по Сэнгеру 28
2.10 Статистическая обработка данных 29
3 Результаты и обсуждения 31
3.1 Геномное картирование делеции 7-8 экзона гена GBP3 31
3.2 Анализ ассоциации делеции 7-8 экзона гена GBP3 с атеросклерозом у человека 35
ВЫВОДЫ 39
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 40
ПРИЛОЖЕНИЕ А 45
ПРИЛОЖЕНИЕ Б 46
Структурная вариабельность генома сыграла важную роль в эволюционной реструктуризации генома человека и является важным аспектом в понимании молекулярной основы различных заболеваний, таких как, ожирение, сахарный диабет 2 типа, ишемическая болезнь сердца, болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона, а также онкологических заболеваний.
Открытие субмикроскопических вариаций числа копий участков ДНК присутствующих в геномах изменило взгляды на структурную вариабельность и заболевания. Считается, что CNV включают в себя больше нуклеотидов и возникают чаще, чем SNP. Структурная вариабельность генома в большей степени, чем SNP, ответственны за эволюцию человека, генетическое разнообразие между людьми и быстро растущее число признаков или восприимчивость к признакам. В дополнение к хорошо известным синдромам спорадической хромосомной микроделеции и менделеевским заболеваниям, CNV могут быть результатом различные заболеваний, включая аутизм и шизофрению.
Гуанилат-связывающие белки (Guanylate-binding proteins, GBP) являются центральными регуляторами иммунитета к инфекциям, воспалениям и неопластическим заболеваниям. В пределах множества типов клеток-хозяев IFN-индуцированные гуанозинтрифосфаты выполняют различные защитные действия против широкого спектра микробных патогенов. Кроме того, GBP настраивает ответы инфламмасом на бактериальную инфекцию и сепсис, действуя как регуляторы для усиления адаптивного иммунитета и регулирования повреждения тканей. Подобные функции становятся очевидными для метаболических воспалительных синдромов и онкологии, что подчеркивает важность GBP в инфекционных и измененных гомеостаза.
Атеросклероз - это процесс отложения холестерина в стенке сосудов, и формирование атеросклеротических бляшек, вызывающих сужение артерии, с уменьшением поступления крови к органам (ишемия) и последующего тромбоза с полной закупоркой артерии (окклюзия). GBP могут участвовать в активации макрофагов при атеросклерозе. Недавно обнаружено, что GBP имеет структурную вариабельность, в частности GBP3 белок.
Таким образом, предполагается что мутации в гене GBP по типу CNV могут играть роль в риске формирования атеросклероза, а также в особенностях клинических проявлений атеросклеротического процесса.
Цель исследования:
Характеристика делеции 7 и 8 экзона гена гуанилат-связывающего белка 3 и его связь с атеросклерозом.
Задачи:
1. Разработка праймеров и оптимизация протокола ПЦР для оценки делеции 7 и 8 экзона гена GBP3 у человека.
2. Определение “горячих точек” делеции 7 и 8 экзона гена GBP3 с помощью секвенирования по Сэнгеру.
3. Анализ частот и генотипов делеции 7 и 8 экзона гена GBP3 у лиц без клинических проявлений со стороны сердечно-сосудистой системы и у пациентов с каротидным атеросклерозом.
4. Анализ ассоциации структурных вариантов гена GBP3 с атеросклерозом человека.
Работа выполнена на базе лаборатории популяционной генетики НИИ Медицинской генетики Томского национального исследовательского медицинского центра Российской академии наук под руководством канд. мед. наук А. А. Слепцова.
1. Разработан набор праймеров, позволяющий провести детекцию делеции 7 и 8 экзона гена GBP3 у человека за одну ПЦР реакцию. Полученные результаты могут быть использованы для диагностики наличия данной делеции.
2. Делеция 7 и 8 экзона гена GBP3 составляет 2716 п. н. и представлена только одним вариантом - горячие точки располагаются с 89012941 по 89010226 нуклеотид хромосомы 1 человека (геномная сборка hg38). Кроме того, показано, что делеция входит в состав двух гаплотипов, сцепленных с полиморфными вариантами rs12136785 и rs14838176 соответственно.
3. Делеция экзонов 7-8 гена GBP3 могла быть вызвана рекомбинацией Alu-элементов AluSz6 и AluSx, в результате которого образовался новый Alu-элемент AluSc.
4. Делеция 7 и 8 экзона гена GBP3, по-видимому, не является редким событием, и в гомозиготном состоянии встречается у 16 % носителей в контрольной выборке.
5. Анализ ассоциации делеции 7-8 экзона гена GBP3 с атеросклерозом у человека показал, что делеция обладает протективным эффектом (p-value 0.05; ОШ 0,33; 95 % ДИ 0,12-0,83).
