Аннотация
Список использованных сокращений 3
Введение 4
1 Обзор литературы 7
1.1 Невынашивание беременности у человека 7
1.2 Причины невынашивания беременности 9
1.2.1 Генетические факторы риска невынашивания 10
1.2.2 Эпигенетические факторы риска невынашивания беременности 13
1.2.3 Влияние родительских факторов и факторов среды на риск
невынашивания беременности 16
1.3 Нарушение метилирования генов развития плаценты у спонтанных
абортусов 18
1.4 Ген развития плаценты PSG2 19
1.5 Методы анализа экспрессии генов 21
2 Материалы и методы 23
2.1 Материалы 23
2.2 Методы 23
2.2.1 Подбор праймеров для qRT-PCR 23
2.2.2 Выделение РНК тризолом из тканей абортусов 25
2.2.3 Очистка выделенной РНК 27
2.2.4 Получение кДНК 27
2.2.5 ПЦР в режиме реального времени 28
2.2.6 Электрофорез в агарозном геле 29
2.2.7 Статистическая обработка данных 29
3 Результаты и обсуждение Error!
Выводы 31
Список использованной литературы 32
Приложение А 39
Частота самопроизвольного прерывания беременности в России достаточно высокая и прогрессирующая, она колеблется от 15 до 23% всех зарегистрированных беременностей, при этом около 80% репродуктивных потерь приходится на I триместр беременности [1]. Привычное невынашивание беременности (ПНБ) — это потеря двух и более беременностей подряд, которые затрагивают до 5% супружеских пар в популяции [5].
Существует множество причин, которые приводят к самопроизвольному выкидышу, причем 10-11% из них характеризуются наличием хромосомных аномалий у развивающегося плода. Это связано с тем, что на определенном этапе его внутриутробного развития (в сроке до 22 недель) появляются аномалии развития, которые несовместимы с жизнью. Хромосомные нарушения могут приводить к нарушению беременности, хотя чаще всего выкидыши происходят в сроках до 11 недель беременности. Трисомия по 16 хромосоме является самым распространенным хромосомным нарушением, чуть реже встречается моносомия Х хромосомы (45,Х) [6].
Основная трудность в определении непосредственной причины прерывания беременности связана с тем, что невынашивание беременности является многофакторным процессом, в котором одни факторы могут иметь первостепенное значение, а другие будут являться фоном.
Тяжесть фенотипа ранней эмбриональной гибели обусловливает возможность существования в этом периоде и масштабных эпигенетических нарушений. Действительно, значительные нарушения метилома выявлены в плаценте при различных патологиях беременности: преэклампсии, задержке роста плода, гестационном диабете [2]. Особый интерес представляют гены, нарушения метилирования которых обнаруживаются при различных патологиях беременности.
Экспрессия гена PSG2 является одним из наиболее информативных специфических маркеров беременности. Ген PSG2 отличается особо важными функциональными проявлениями во время беременности. Низкий уровень белка, кодируемый геном PSG2 в крови матери связан с более частыми спонтанными абортами, задержкой развития, низким весом при рождении и гипоксией плода [3, 4, 7]. Ранее проведенный анализ уровня метилирования гена PSG2 в ворсинах хориона спонтанных абортусов с помощью таргетного бисульфитного массового параллельного секвенирования показал, что PSG2 гиперметилирован у спонтанных абортусов с трисомией 16 и в группе с нормальным кариотипом и повышенным уровнем метилирования LINE-1 [8].
Целью данной работы является анализ уровня экспрессии гена PSG2 в ворсинах хориона спонтанных абортусов первого триместра беременности.
Для достижения цели поставлены следующие задачи:
1. Осуществить подбор пары олигонуклеотидных праймеров для региона PSG2 и поиск референсного гена с наиболее стабильной экспрессией для нормализации данных при исследовании экспрессии гена PSG2 в ворсинах хориона спонтанных абортусов первого триместра беременности.
2. Определить уровень экспрессии гена PSG2 в ворсинах хориона спонтанных абортусов с аномальным кариотипом (трисомия 16 и моносомия X) и с нормальным кариотипом с пониженным и повышенным уровнями метилирования LINE-1 и медицинских абортусов с помощью ПЦР в реальном времени.
3. Проанализировать корреляцию между уровнями метилирования и экспрессией гена PSG2 при невынашивании беременности.
4. Провести анализ связи дифференциального уровня метилирования с уровнем экспрессии исследуемых генов в хорионе спонтанных и медицинских абортусов.
Исследование выполнено на базе лаборатории инструментальной геномики НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ под руководством доктора биологических наук Васильева Станислава Анатольевича. Автор выражает благодарность научному руководителю за помощь при написании выпускной квалификационной работы.
1. Средняя экспрессия гена PSG2 снижена в группе спонтанных абортусов в 9,5 раз по сравнению с медицинскими абортусами (p=0,044).
2. При разделении спонтанных абортусов на подгруппы с различным кариотипом (нормальный кариотип, моносомия X, трисомия 16) значимых отличий от группы медицинских абортусов по уровню экспрессии гена PSG2 обнаружено не было.
3. Уровень экспрессии PSG2 в ворсинах хориона 3 из 14 (21%) спонтанных абортусов был значительно ниже всех проанализированных медицинских абортусов.
4. Уровень экспрессии гена PSG2 значимо коррелировал со средним уровнем метилирования в регионах генов ADORA2B (регион 3, R=-0,48, p=0,036), PTHLH (R=-0,46, p=0,049) и средним уровнем метилирования всех проанализированных регионов генов (R=-0,53, p=0,020).
