ВВЕДЕНИЕ 4
ГЛАВА 1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6
1.1 Проблемы нефтезагрязнения окружающей среды 6
1.2 Состав нефти 8
1.3 Транспорт субстратов в клетки микроорганизмов 11
1.4 Окислительная активность углеводородокисляющей микрофлоры 11
1.5 Типичные представители углеводородокисляющей микрофлоры 14
1.5.1 Род Bacillus 14
1.5.2 Род Micrococcus 15
1.5.3 Дрожжи 16
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 17
2.1 Объекты исследования 17
2.1.2 Нефть месторождений Снежное и Ханты-Мансийское 17
2.2 МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 18
2.2.1 Состав и посев на твердую среду 18
2.2.2 Состав и посев на жидкие среды 18
2.2.3 Метод разведения и высева на плотные агаровые среды (метод Коха) 19
2.2.4 Метод окраски по Граму 21
2.2.5 Методика определения активности каталазы 21
2.2.6 Методика определения дегидрогеназной активности 23
2.2.7 Методы экстракции органического вещества на аппарате Сокслета из твердой субстанции
(почва) 24
2.2.8 Экстракция органического вещества хлороформом из жидкой среды 24
2.2.9 Моделирование процессов биодеструкции нефти в водной среде 25
2.2.10 Метод ИК-спектрального анализа органического вещества нефти 26
2.2.11 Моделирование процессов биодеструкции нефти в почве 27
2.2.12 Определение содержания нефти в почве 27
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 29
3.1 Изучение микробного состава отобранных проб мха 29
3.2 Окислительная активность чистых культур микроорганизмов, выделенных из проб мха и донных осадков в жидкой фазе 33
3.2.1 ИК-спектрометрический анализ биодеструктивных изменений в составе функциональных групп нефти в процессе биодеструкции нефти в водной фазе 37
3.3 Биодеструкция нефти, загрязняющей почву с использованием микроорганизмов, выделенных из проб мха и донных осадков 38
ВЫВОДЫ 45
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ 46
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 47
ПРИЛОЖЕНИЕ А 51
ПРИЛОЖЕНИЕ Б 54
Органическая природа, сложный многокомпонентный состав, токсичность в целом и отдельных компонентов, масштабность распространения и высокая миграционная способность характеризуют один из самых распространенных загрязнителей природной среды - нефть и нефтепродукты (Рогозина, 2006).
В свою очередь роль нефти в современной мировой экономике высока. Она является сырьем для производства топлива, синтетических материалов, продукты её переработки используются в производстве электроэнергии и тепла. Использование нефти определяет уровень экономического развития и жизни современного человека (Владимиров, 2014).
Широкое её использование привело к повсеместному загрязнению окружающей среды. Загрязнение почв происходит на буровых площадках и центральных пунктах сбора, также масштабы загрязнения значительно увеличиваются за счет воздействия нефтехранилищ, нефтебаз, автозаправочных и нефтенасосных станций, факельных устройств, автомобильных и железных дорог, автомобильных и железных дорог (Смольникова, 2009). В загрязненной углеводородами почве замедляются процессы минерализации, снижается способность к самоочищению, её биологическая ценность (Смольникова, 2009). Почва, загрязненная нефтью и нефтепродуктами является потенциальным источником миграции углеводородов по экологическим пищевым цепям (Абросимова, 2002; Голдовская, 2005). В свою очередь это приводит к угнетению дыхательной активности почвы, которая может вызвать депрессию флоры и фауны, также нарушается соотношение между отдельными группами микроорганизмов, угнетаются процессы нитрификации, азотфиксации, активизируется патогенная и условно-патогенная микрофлора, нарушается баланс почвенных ферментов.
Для решения данных проблем используются механические, химические, физико-химические, термические методы, которые имеют ряд отрицательных черт, а именно высокая стоимость очистки, возможность загрязнения субстратов моющими средствами, ухудшение механических и агрохимических свойств почвы.
Наиболее безопасными, перспективными и эффективными являются биологические методы, в основе которых лежит внесение в загрязненную среду микробиологических препаратов, содержащих штаммы микроорганизмов, которые способны к активному окислению нефтяных углеводородов. Биологические методы способствуют не только очистить почву и водные экосистемы от углеводородов нефти, но и также восстановить её экологические функции, добиться деградации нефтяных углеводородов до веществ, не оказывающих отрицательного влияния и стабилизировать её агрохимические свойства.
Цель данной работы является: оценка возможности ускорения деструкции углеводородов нефти, загрязняющих водную фазу и почву путем внесения дополнительной микрофлоры группы углеводородокисляющих, выделенных из проб мха, отобранных во время экспедиции в Архангельской области (Арктическая зона).
В соответствии с целью были сформулированы следующие задачи:
1) Исследовать динамику численности чистых культур микроорганизмов в процессе биодеструкции нефти;
2) Оценить ферментативную активность микроорганизмов в зависимости от их численности;
3) Определить эффективность биодеструкции нефти в почве и воде.
1) При культивировании микроорганизмов в жидкой среде, загрязненной нефтью (2%), максимальная численность составила 22.3*106 КОЕ/мл, активность каталазы - 5.3 О?/мл, активность дегидрогеназы - 1.6 ТФФ на 1 мл среды за сутки. Деструкция нефти за 15 суток составила 65%.
2) При культивировании смеси микроорганизмов в нефтезагрязненной почве (2%), максимальная численность составила 1232*103 КОЕ/г, активность каталазы - 20 О2/мл, активность дегидрогеназы - 0.81 ТФФ на 1 мл среды за сутки. Деструкция нефти за 30 суток составила 56%. Посев многолетней газонной травы в нефтезагрязняющую почву повысил активность микроорганизмов в процессах биодеструкции и увеличил утилизацию нефти на 8%.
3) ИК-спектрометрический анализ нефтей после биодеградации чистыми культурами и смесью микроорганизмов показал увеличение коэффициентов окисленности, разветвленности и ароматичности, что подтверждает деструктивную активность ферментов микроорганизмов.