АННОТАЦИЯ 3
Введение 3
1 Литературный обзор 5
1.1 Особенности термофильных микромицетов 5
1.2 Температурный диапазон термофильных микромицетов 7
1.3 Определение понятия «питательная среда», требования к ее составу 8
1.4 Использование углерода микромицетами 9
1.5 Понятие о культивировании микроорганизмов 10
1.6 Способы культивирования аэробных и анаэробных микроорганизмов 11
1.7 Роль термофильных микромицетов в промышленности 13
1.8 Места горения угля 15
1.9 Род Aspergillus 15
2 Материалы и методы 18
2.1 Отбор проб 18
2.2 Выделение чистых культур грибов 18
2.3 Питательные среды для культивирования грибов 18
2.4 Приготовление антибиотика 19
2.5 Методика посева термофильных микромицетов 19
2.6 Выделение ДНК, секвенирование и филогенетический анализ 20
2.7 Определение температурного диапазона культур 21
3 Результаты 22
Заключение 26
Список использованной литературы 27
Приложение А Ближайшие родственники выделенных к
Промышленное производство, как известно, является одним из обязательных условий нормальной жизнедеятельности современного общества. Каждый этап любого производства, начиная с производства сырья и заканчивая переработкой отходов, сопровождается загрязнением окружающей среды. Наличие доступной для потребления энергии всегда было необходимо для удовлетворения потребностей человека, но даже производство энергии связано с сильным загрязнением воздуха, воды и почвы [Ситаров В. А., 2000].
Исследования термофильных микромицетов показали, что они способны производить термофильные ферменты, которые могут использоваться в промышленности, биотехнологии и для улучшения экологической ситуации нашей планеты: для очистки загрязненной почвы и сточных вод [Edgar T. F., 1983]. Кроме того, термофильные микромицеты могут производить эти ферменты с большей скоростью, чем мезофильные организмы. Поэтому намного выгоднее использовать термофильные микромицеты для производства ферментов в больших масштабах, так как они не требуют никакой системы охлаждения для поддержания желаемой температуры [Adams M. W., 1994].
Для благоприятного развития грибов, способных выдерживать высокие температуры, необходимы тепло, высокая влажность и наличие органических материалов, используемых в процессе добычи угля.
Образцы грибов, с которыми проводилась работа, взяты в Кузбассе. Кузнецкий угольный бассейн (Кузбасс), который является одним из самых крупных угольных месторождений мира, расположен на юге Западной Сибири, в основном на территории Кемеровской области (частично - на территории Новосибирской области и Алтайского края), в неглубокой котловине между горными массивами Кузнецкого Алатау. Площадь бассейна около 26 тыс. км2. Балансовые запасы его составляют 600 млрд. тонн; мощность пластов от 6 - 14 м., а в ряде мест достигает 20 - 25 м; средняя глубина разработки угольных пластов шахтным методом достигает 315 м. Бассейн имеет благоприятные горно-геологические условия разработки, что обеспечивает их низкую себестоимость [Безруков Л. А., 2016].
Целью нашего исследования стало определение филогенетического положения термофильных микромицетов молекулярными методами и определение температурного диапазона для роста выделенных культур.
В соответствии с поставленной целью работы были сформулированы следующие задачи:
1. Выделить и очистить термофильные микромицеты;
2. Провести филогенетический анализ штаммов по последовательности ITS;
3. Определить диапазон температур для роста выделенных культур.
Работа выполнена на базе лаборатории биохимии и молекулярной биологии при кафедре физиологии растений, биотехнологии и биоинформатики Биологического института Национального исследовательского Томского государственного университета.
Автор выражает благодарность заведующей кафедрой физиологии растений, биотехнологии и биоинформатики Томского государственного университета доктору биологических наук, профессору О. В. Карначук за возможность выполнить исследования на высоком методическом уровне, научному руководителю старшему преподавателю Л. О. Соколянской за руководство и помощь в работе. Автор признателен Л. Б. Глуховой за помощь при выделении ДНК штаммов и проведении филогенетического анализа и А. Е. Калининой за помощь в проведении экспериментов и предоставлении штаммов микромицетов для работы.
Исходя из поставленной цели нашего исследования, можно сделать следующие выводы:
1. Из отобранных проб были выделены термофильные микромицеты на жидких средах Чапека Докса и S. Tsujiyama при температуре 50 - 55 °С.
2. В результате филогенетического анализа было определенно, что из проб B - 32, Bu - 33, 34, 35 и RBS - 31, 32, 33 был выделен штамм Aspergillus fumigates.
Микромицеты, растущие при температуре 50°С, родственные A. fumigatus впервые выделены из горящих отходов добычи угля. Дополнительное определение последовательностей белковых маркеров CaM, BenA и RPB2, рекомендованных для филогенетического анализа рода Aspergillus, показало, что некоторые из изолятов могут представлять новые виды.
3. В результате проведенного эксперимента по определению диапазона температур роста проб RBS - 31, 32, 33, установили, что для штаммов RBS - 31 и RBS -
32 максимальная температура роста составила 50 °C, а минимальная была выше 20 °C. Для RBS - 33 максимальная температура роста равна 55 °C, а минимальная 5 °C. Оптимум для штамма RBS - 31 составлял 45 °С, а для штамма RBS - 32 - 37 °С. Изолят RBS - 33 относился к термотолерантным организмам с оптимумом 26 °С.
