ИССЛЕДОВАНИЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ СВОЙСТВ ЭЛАСТИНА И КОЛЛАГЕНА МЕТОДОМ МНОГОФОТОННОЙ МИКРОСКОПИИ
|
АННОТАЦИЯ 3
ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СОКРАЩЕНИЙ 3
ВВЕДЕНИЕ 4
1 Нелинейные оптические эффекты, основанные на двухфотонном поглощении:
флуоресценция и генерация второй гармоники 6
1.1 Нелинейные процессы в среде 6
1.2 Флуоресценция 8
1.3 Время жизни. Затухание флуоресценции. Квантовый выход 10
1.4 Двухфотонное возбуждение флуоресценции 11
1.5 Генерация второй гармоники 13
1.6 Метод изображения времени жизни флуоресценции с использованием время -
коррелированного счета одиночных фотонов 14
2 Многофотонный микроскоп JenLab Microscope MPTflex10 18
2.1 Основные характеристики прибора 18
2.2 Принцип работы и устройство микроскопа 19
2.3 Оборудование: Фемтосекундный лазер Mai Tai XF 1, Фокусирующая система 40x NA
1.3 oil 23
2.4 Программное обеспечение SPCimage 24
3 Кожа. Эластические и коллагеновые волокна дермы 27
3.1 Строение кожи 27
3.2 Биохимия эластических и коллагеновых волокон 29
3.3 Фотофизические параметры коллагена и эластина 31
3.4 Источники автофлуоресценции и оптических гармоник 32
3.5 Флуоресцирующие сшивки эластических и коллагеновых волокон 34
4 Исследование волокон коллагена и эластина дермы кожи крыс методом FLIM
многофотонной микроскопии 37
4.1 Получение снимков дермы кожи методом многофотонной микроскопии, определение
эластических и коллагеновых волокон, дифференциация слоев дермы 37
4.2 Анализ флуоресцентных характеристик волокон эластина, при помощи программного
обеспечения SPCImage NG 8.1 39
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 45
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 46
ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СОКРАЩЕНИЙ 3
ВВЕДЕНИЕ 4
1 Нелинейные оптические эффекты, основанные на двухфотонном поглощении:
флуоресценция и генерация второй гармоники 6
1.1 Нелинейные процессы в среде 6
1.2 Флуоресценция 8
1.3 Время жизни. Затухание флуоресценции. Квантовый выход 10
1.4 Двухфотонное возбуждение флуоресценции 11
1.5 Генерация второй гармоники 13
1.6 Метод изображения времени жизни флуоресценции с использованием время -
коррелированного счета одиночных фотонов 14
2 Многофотонный микроскоп JenLab Microscope MPTflex10 18
2.1 Основные характеристики прибора 18
2.2 Принцип работы и устройство микроскопа 19
2.3 Оборудование: Фемтосекундный лазер Mai Tai XF 1, Фокусирующая система 40x NA
1.3 oil 23
2.4 Программное обеспечение SPCimage 24
3 Кожа. Эластические и коллагеновые волокна дермы 27
3.1 Строение кожи 27
3.2 Биохимия эластических и коллагеновых волокон 29
3.3 Фотофизические параметры коллагена и эластина 31
3.4 Источники автофлуоресценции и оптических гармоник 32
3.5 Флуоресцирующие сшивки эластических и коллагеновых волокон 34
4 Исследование волокон коллагена и эластина дермы кожи крыс методом FLIM
многофотонной микроскопии 37
4.1 Получение снимков дермы кожи методом многофотонной микроскопии, определение
эластических и коллагеновых волокон, дифференциация слоев дермы 37
4.2 Анализ флуоресцентных характеристик волокон эластина, при помощи программного
обеспечения SPCImage NG 8.1 39
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 45
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 46
Эластин и коллаген одни из основных белков соединительной ткани, на долю которых приходится более 6% веса тела человека. Данные белки, содержащие в своем составе более 1000 аминокислот и аминокислотных остатков, чувствительны ко многим метаболическим изменениям в организме, которые связаны с широчайшим спектром различных патологий. К данным патологиям относятся: ряд онкологических процессов, многие кожные заболевания, процессы старения, некоторые аутоимунные заболевания, процессы фиброза, присущие многим системным болезням. Кроме того, существует более 400 типов мутаций в генах данных фибриллярных белков, связанных с различными заболеваниями человека. Все эти процессы влияют на состояние эластина и коллагена, позволяя использовать многие параметры этих белков в качестве биомаркеров. Эластические и коллагеновые волокна, включающие в себя эластин и коллаген, в большом количестве содержатся в коже и слизистых, что позволяет успешно проводить их неинвазивное изучение методами биофотоники, в частности, при помощи метода многофотонной микроскопии [1] Использование методов, основанных на многофотонной микроскопии (МФМ) - эффективный инструмент биофотоники, который позволяет производить оценку состояния кожных покровов и слизистых [2, 3, 4, 5, 6, 7,]. Методы, основанные на МФМ, могут обеспечить быструю и неинвазивную диагностику высокой точности, сокращая время исследования и уменьшая вероятность ошибки, связанной с человеческим фактором. Многофотонная микроскопия, как оптический метод диагностики, позволяет изучать процессы в живых организмах и их тканях на молекулярном и клеточном уровне. Преимущества многофотонной микроскопии и способы ее применения описываются во многих научных трудах как Российских, так и зарубежных авторов [2, 3, 5,
6] . Метод МФМ имеет большие перспективы в диагностике и изучении злокачественных новообразований, помогая определить концентрацию и наличие различных биомаркеров в тканях, которые являются характерными признаками онкологических процессов [8, 9, 10, 11, 12]. Доказано, что такие характеристики, как времена жизни флуоресценции и
амплитуды флуоресценции различных эндогенных флуорофоров в тканях, в том числе в белках, чувствительны к изменениям метаболического состояния организма [ 13, 2]. Данные характеристики крайне успешно изучаются методом МФМ. Благодаря низкой мощности воздействующего излучения (до 50 милливатт), данный способ исследования имеет низкую фототоксичность и оставляет исследуемые образцы не поврежденными. Используя метод МФМ, мы можем изучить морфологическую структуру различных здоровых и патологичных тканей. Данный метод позволяет исследовать биоматериал ex vivo, например, биопсии опухолей глубоких тканей и внутренних органов, и in vivo, применяя МФМ для изучения кожных покровов, слизистых оболочек и при проведении эндоскопических исследований [9, 10, 11, 14]. Многофотонная флуоресцентная микроскопия является одним из вариантов лазерной сканирующей микроскопии, при котором флуорохромы возбуждаются лазерным излучением инфракрасного или длинноволнового видимого диапазона, благодаря чему не требуется дополнительная окраска. Так как флуоресценция возникает строго в фокальной плоскости, меняя фокусное расстояние, мы можем регистрировать сигнал на разной глубине. Благодаря этому, возможно построить послойную 3D модель исследуемого объекта [2, 3].
Данная работа будет посвящена использованию метода многофотонной микроскопии для исследования коллагеновых и эластических волокон дермы кожи крыс, на сертифицированном многофотонном томографе (микроскопе) MPTflex10 немецкой фирмы JenLab, в ближней инфракрасной области спектра, на длине волны 760 нм, в ближней инфракрасной области спектра. Основной целью работы является: исследование флуоресцентных свойств эластических и коллагеновых волокон in vivo методом многофотонной микроскопии. Упор будет произведен на способ изображения времени жизни флуоресценции и других флуоресцентных параметров, использующий время- коррелированный счет одиночных фотонов - TCSPC FLIM (Time Correlated Single Photon Counting for Fluorence Lifetime Imaging), описывающий время жизни флуоресценции различных эндогенных флуорофоров. Также, нами будет использована генерация оптических гармоник, и будет проведен анализ автофлуоресценции слоев дермы кожи крысы. Задачами данной дипломной работы являются: применение метода многофотонной микроскопии для анализа волокон эластина и коллагена на модели мелких животных, изучение литературы на тему физических и биологических свойств белков соединительной ткани: коллагена и эластина, проведение экспериментов по регистрации сигнала автофлуоресценции и генерации второй гармоники эластических и коллагеновых волокон, получение изображений волокон соединительной ткани методом многофотонной микроскопии, дифференциация рассматриваемых структур, определение таких флуоресцентных характеристик эластина, как: среднее время жизни флуоресценции, время жизни быстрой и медленной компоненты, отношение амплитуд медленной и быстрой компоненты, при помощи программного обеспечения SPCImage NG 8.1, расчет среднеквадратичных отклонений данных параметров, анализ разброса
6] . Метод МФМ имеет большие перспективы в диагностике и изучении злокачественных новообразований, помогая определить концентрацию и наличие различных биомаркеров в тканях, которые являются характерными признаками онкологических процессов [8, 9, 10, 11, 12]. Доказано, что такие характеристики, как времена жизни флуоресценции и
амплитуды флуоресценции различных эндогенных флуорофоров в тканях, в том числе в белках, чувствительны к изменениям метаболического состояния организма [ 13, 2]. Данные характеристики крайне успешно изучаются методом МФМ. Благодаря низкой мощности воздействующего излучения (до 50 милливатт), данный способ исследования имеет низкую фототоксичность и оставляет исследуемые образцы не поврежденными. Используя метод МФМ, мы можем изучить морфологическую структуру различных здоровых и патологичных тканей. Данный метод позволяет исследовать биоматериал ex vivo, например, биопсии опухолей глубоких тканей и внутренних органов, и in vivo, применяя МФМ для изучения кожных покровов, слизистых оболочек и при проведении эндоскопических исследований [9, 10, 11, 14]. Многофотонная флуоресцентная микроскопия является одним из вариантов лазерной сканирующей микроскопии, при котором флуорохромы возбуждаются лазерным излучением инфракрасного или длинноволнового видимого диапазона, благодаря чему не требуется дополнительная окраска. Так как флуоресценция возникает строго в фокальной плоскости, меняя фокусное расстояние, мы можем регистрировать сигнал на разной глубине. Благодаря этому, возможно построить послойную 3D модель исследуемого объекта [2, 3].
Данная работа будет посвящена использованию метода многофотонной микроскопии для исследования коллагеновых и эластических волокон дермы кожи крыс, на сертифицированном многофотонном томографе (микроскопе) MPTflex10 немецкой фирмы JenLab, в ближней инфракрасной области спектра, на длине волны 760 нм, в ближней инфракрасной области спектра. Основной целью работы является: исследование флуоресцентных свойств эластических и коллагеновых волокон in vivo методом многофотонной микроскопии. Упор будет произведен на способ изображения времени жизни флуоресценции и других флуоресцентных параметров, использующий время- коррелированный счет одиночных фотонов - TCSPC FLIM (Time Correlated Single Photon Counting for Fluorence Lifetime Imaging), описывающий время жизни флуоресценции различных эндогенных флуорофоров. Также, нами будет использована генерация оптических гармоник, и будет проведен анализ автофлуоресценции слоев дермы кожи крысы. Задачами данной дипломной работы являются: применение метода многофотонной микроскопии для анализа волокон эластина и коллагена на модели мелких животных, изучение литературы на тему физических и биологических свойств белков соединительной ткани: коллагена и эластина, проведение экспериментов по регистрации сигнала автофлуоресценции и генерации второй гармоники эластических и коллагеновых волокон, получение изображений волокон соединительной ткани методом многофотонной микроскопии, дифференциация рассматриваемых структур, определение таких флуоресцентных характеристик эластина, как: среднее время жизни флуоресценции, время жизни быстрой и медленной компоненты, отношение амплитуд медленной и быстрой компоненты, при помощи программного обеспечения SPCImage NG 8.1, расчет среднеквадратичных отклонений данных параметров, анализ разброса
Получены изображения морфологических структур дермы, таких, как коллагеновые и эластические волокна, фибробласты и поперечные срезы кровеносных сосудов (предположительно). Слои дермы успешно дифференцированы по структуре коллагена, эластина и наличию фибробластов и сосудов, выделено два слоя дермы: сосочковый и сетчатый слой. Также, определены такие оптические характеристики эластического волокна дермы крысы, как среднее время жизни флуоресценции волокна: тт = 1399 ± 208, времена жизни флуоресценции экспоненциальных компонент аппроксимации: т1 = 506 ± 151, т2 = 2580 ± 165 и отношение амплитуд флуоресценции медленной и быстрой компоненты: a1/a2 = 1,35 ± 0,2. Рассчитаны среднеквадратичные отклонения данных величин, установлено, что флуоресцентные свойства волокон сильнее отличаются друг от друга на большом расстоянии, в пределах 1 X 1 см, чем в малой локальной области, размером 75 X 75 мкм. Доказано, что флуоресцентные характеристики волокон эластина крыс подчиняются тем же распределениям, что и флуоресцентные характеристики волокон эластина человека, что позволяет использовать модель мелких животных на примере крысы для изучения человеческих патологий, связанных с изменением флуоресцентных свойств эластина. По гистограммам распределения флуоресцентных параметров определено, что вышеперечисленные параметры подчиняются одномодовому распределению, также подтверждено предположение о том, что эластические волокна представляют собой совокупность флуоресцирующих компонент, минимальное количество которых равняется двум. Найденные флуоресцентные параметры эластина могут быть использованы в дальнейшем для создания программного обеспечения, предназначенного для автоматического поиска данных волокон на изображениях, полученных методом МФМ, также, данные значения (при увеличении выборки), могут считаться референсными значениями здоровых волокон, с которыми будут сравниваться значения, снятые с патологических образцов.
