ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ АНТИФИБРОТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ НА ВОСПАЛЕНИЕ В ЛЁГКИХ МЫШЕЙ ЛИНИИ C57BL/6 В УСЛОВИЯХ ФИБРОЗА ЛЁГКОГО
|
АННОТАЦИЯ 3
Список сокращений 3
Введение 5
1 Обзор литературы 8
1.1 Этиология идиопатического легочного фиброза 8
1.2 Патогенез идиопатического легочного фиброза 12
1.3 Применение антифибротических средств для снижения скорости потери
газообменной функции легких 17
2 Материалы и методы 24
2.1 Объект исследования 24
2.2 Оценка смертности, общий осмотр, оценка массы тела 25
2.3 Экспериментальная модель блеомицин-индуцированного пневмофиброза 25
2.4 Процедура введения препаратов и растворителя 26
2.5 Окраска гистологических срезов 26
2.6 Оценка степени воспаления в легких 26
2.7 Морфологическое исследование препаратов легких 27
2.8 Иммуноферментный метод оценки содержания веществ в гомогенате легкого 28
2.9 Статистическая обработка экспериментальных данных 28
3 Результаты и их обсуждение 29
3.1 Влияние антифибротических препаратов на общее состояние мышей и их массу
тела 29
3.2 Изменение степени воспаления в легких при введении антифибротических
препаратов 33
3.3 Влияние пирфенидона и нинтеданиба на степень фиброзирования легких 35
3.4 Изменение уровня медиаторов фиброза в условиях терапии пирфенидоном и
нинтеданибом 38
Заключение 42
Выводы 44
Список использованной литературы 45
Список сокращений 3
Введение 5
1 Обзор литературы 8
1.1 Этиология идиопатического легочного фиброза 8
1.2 Патогенез идиопатического легочного фиброза 12
1.3 Применение антифибротических средств для снижения скорости потери
газообменной функции легких 17
2 Материалы и методы 24
2.1 Объект исследования 24
2.2 Оценка смертности, общий осмотр, оценка массы тела 25
2.3 Экспериментальная модель блеомицин-индуцированного пневмофиброза 25
2.4 Процедура введения препаратов и растворителя 26
2.5 Окраска гистологических срезов 26
2.6 Оценка степени воспаления в легких 26
2.7 Морфологическое исследование препаратов легких 27
2.8 Иммуноферментный метод оценки содержания веществ в гомогенате легкого 28
2.9 Статистическая обработка экспериментальных данных 28
3 Результаты и их обсуждение 29
3.1 Влияние антифибротических препаратов на общее состояние мышей и их массу
тела 29
3.2 Изменение степени воспаления в легких при введении антифибротических
препаратов 33
3.3 Влияние пирфенидона и нинтеданиба на степень фиброзирования легких 35
3.4 Изменение уровня медиаторов фиброза в условиях терапии пирфенидоном и
нинтеданибом 38
Заключение 42
Выводы 44
Список использованной литературы 45
Идиопатический легочный фиброз (ИЛФ) - тяжелое хроническое прогрессирующее фиброзное заболевание легких, характеризующееся прогрессирующим рубцеванием интерстиция легких, которое обычно поражает пожилых пациентов старше 60 лет. Накопление соединительной ткани и искажение ультраструктуры легкого приводят к прогрессирующей потере эластичности легких и снижению газообменных свойств. Распространенность этого заболевания оценивается в 2-29 случаев на 100 000 человек, а его заболеваемость составляет около 3-9 случаев на 100 000 человек в год [1]. Прогрессирующее образование рубцов ео временем ухудшает симптомы: больные испытывают одышку, усталость и кашель, что оказывает пагубное влияние на качество жизни пациентов и кроме того, приводит к психологическому стрессу [2]. Медиана выживаемости с момента постановки диагноза составляет всего 3-5 лет при отсутствии положительной динамики терапии [3]. Наиболее важными известными прогностическими детерминантами смертности являются снижение функции легких, а также легочная гипертензия [4].
Современные методы лечения ИЛФ замедляют прогрессирование заболевания, но не излечивают его. Трансплантация легких возможна только для небольшой подгруппы пациентов, и большинство пациентов в первую очередь полагаются на антифиброзную терапию, а также поддерживающие и паллиативные меры.
Ежегодно во всем мире проводится более 4600 трансплантаций легких, примерно половина из которых выполняется по поводу интерстициального заболевания легких, включая идиопатический фиброз легких [5]. ИЛФ в настоящее время является наиболее распространенным показанием для проведения трансплантации легких во всем мире. К сожалению, трансплантация легких, как и многие другие способы терапии ИЛФ, в итоге тоже малоэффективны и имеют множество побочных проявлений и последствий для пациентов [6].
За последнее десятилетие были достигнуты значительные успехи в фармакотерапевтических подходах терапии ИЛФ. На данный момент для лечения ИЛФ доступны лишь два зарегистрированных антифибротических средства, нинтеданиб и пирфенидон, и те полностью не останавливают прогрессирование болезни, а зачастую скорее снижают качество жизни больных ввиду побочных эффектов. Оба препарата продемонстрировали некоторую эффективность в снижении частоты тяжелых респираторных событий, таких как обострения, и госпитализаций по поводу респираторных событий, но они не улучшают функциональные показатели легких.
В настоящее время этиология ИЛФ неизвестна, а ее патогенез до конца не выяснен. Возможные причинные факторы, такие как старение, генетические различия, среда обитания и эпигенетическое перепрограммирование, могут индуцировать развитие заболевания у людей. Появляется все больше доказательств в поддержку идеи о том, что нарушение легочной иммунной системы является важным фактором, способствующим развитию ИЛФ. Иммунные клетки играют роль как в иммунном ответе, так и в воспалительном ответе, и они секретируют большое количество цитокинов и хемокинов, влияющих на регенерацию тканей. Именно поэтому важно исследовать легочный фиброз с точки зрения воспалительного процесса, чтобы найти действенные методы лечения данного заболевания.
В связи с этим изучение влияния нинтеданиба и пирфенидона на воспаление при фиброзе легкого поможет прояснить механизмы его действия на ткань и выявить пути модификации лечения данным препаратом для уменьшения или исключения его побочных действий. Одним из таких действий является снижение аппетита, которое влечет за собой стремительную потерю веса.
Роль иммунной системы при ИЛФ привлекает все большее внимание. Неконтролируемые иммунные реакции способствуют возникновению и прогрессированию ИЛФ. Более глубокое понимание функции иммунной системы в патогенезе и терапии ИЛФ может способствовать разработке таргетной иммуномодулирующей терапии, которая может изменить течение заболевания.
Именно поэтому данное исследование нацелено на показатели локального ответа, в то время как большинство других работ на тему антифибротических препаратов рассматривают системную реакцию организма на препарат.
Цель: изучить влияние препаратов нинтеданиб и пирфенидон на процесс
воспаления и фиброзирования ткани легких у мышей в условиях экспериментального фиброза легких.
Задачи:
1) изучить показатели, отражающие степень воспаления в ткани легкого при патологии и терапии пирфенидоном, нинтеданибом;
2) зафиксировать степень фиброзирования ткани легкого при моделировании пневмофиброза и введении препаратов;
3) оценить уровень содержания цитокинов и компонентов внеклеточного
матрикса в легочной ткани в условиях моделирования пневмофиброза и введения пирфенидона и нинтеданиба.
Работа выполнена на базе НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга ТНИМЦ РАН в лаборатории регенеративной фармакологии под руководством д-ра мед. наук Наталии Николаевны Ермаковой и на базе кафедры физиологии человека и животных Биологического института НИ ТГУ под руководством Елены Юрьевны Федоруцевой.
Современные методы лечения ИЛФ замедляют прогрессирование заболевания, но не излечивают его. Трансплантация легких возможна только для небольшой подгруппы пациентов, и большинство пациентов в первую очередь полагаются на антифиброзную терапию, а также поддерживающие и паллиативные меры.
Ежегодно во всем мире проводится более 4600 трансплантаций легких, примерно половина из которых выполняется по поводу интерстициального заболевания легких, включая идиопатический фиброз легких [5]. ИЛФ в настоящее время является наиболее распространенным показанием для проведения трансплантации легких во всем мире. К сожалению, трансплантация легких, как и многие другие способы терапии ИЛФ, в итоге тоже малоэффективны и имеют множество побочных проявлений и последствий для пациентов [6].
За последнее десятилетие были достигнуты значительные успехи в фармакотерапевтических подходах терапии ИЛФ. На данный момент для лечения ИЛФ доступны лишь два зарегистрированных антифибротических средства, нинтеданиб и пирфенидон, и те полностью не останавливают прогрессирование болезни, а зачастую скорее снижают качество жизни больных ввиду побочных эффектов. Оба препарата продемонстрировали некоторую эффективность в снижении частоты тяжелых респираторных событий, таких как обострения, и госпитализаций по поводу респираторных событий, но они не улучшают функциональные показатели легких.
В настоящее время этиология ИЛФ неизвестна, а ее патогенез до конца не выяснен. Возможные причинные факторы, такие как старение, генетические различия, среда обитания и эпигенетическое перепрограммирование, могут индуцировать развитие заболевания у людей. Появляется все больше доказательств в поддержку идеи о том, что нарушение легочной иммунной системы является важным фактором, способствующим развитию ИЛФ. Иммунные клетки играют роль как в иммунном ответе, так и в воспалительном ответе, и они секретируют большое количество цитокинов и хемокинов, влияющих на регенерацию тканей. Именно поэтому важно исследовать легочный фиброз с точки зрения воспалительного процесса, чтобы найти действенные методы лечения данного заболевания.
В связи с этим изучение влияния нинтеданиба и пирфенидона на воспаление при фиброзе легкого поможет прояснить механизмы его действия на ткань и выявить пути модификации лечения данным препаратом для уменьшения или исключения его побочных действий. Одним из таких действий является снижение аппетита, которое влечет за собой стремительную потерю веса.
Роль иммунной системы при ИЛФ привлекает все большее внимание. Неконтролируемые иммунные реакции способствуют возникновению и прогрессированию ИЛФ. Более глубокое понимание функции иммунной системы в патогенезе и терапии ИЛФ может способствовать разработке таргетной иммуномодулирующей терапии, которая может изменить течение заболевания.
Именно поэтому данное исследование нацелено на показатели локального ответа, в то время как большинство других работ на тему антифибротических препаратов рассматривают системную реакцию организма на препарат.
Цель: изучить влияние препаратов нинтеданиб и пирфенидон на процесс
воспаления и фиброзирования ткани легких у мышей в условиях экспериментального фиброза легких.
Задачи:
1) изучить показатели, отражающие степень воспаления в ткани легкого при патологии и терапии пирфенидоном, нинтеданибом;
2) зафиксировать степень фиброзирования ткани легкого при моделировании пневмофиброза и введении препаратов;
3) оценить уровень содержания цитокинов и компонентов внеклеточного
матрикса в легочной ткани в условиях моделирования пневмофиброза и введения пирфенидона и нинтеданиба.
Работа выполнена на базе НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга ТНИМЦ РАН в лаборатории регенеративной фармакологии под руководством д-ра мед. наук Наталии Николаевны Ермаковой и на базе кафедры физиологии человека и животных Биологического института НИ ТГУ под руководством Елены Юрьевны Федоруцевой.
Идиопатический легочный фиброз (ИЛФ) представляет собой хроническое прогрессирующее заболевание с развитием интерстициального фиброза и нарастающей дыхательной недостаточностью [1]. В большинстве случаев прогноз ИЛФ неблагоприятный, продолжительность жизни больных после диагностики заболевания составляет в среднем около пяти лет [3]. Хотя до сих пор не разработано адекватного медикаментозного лечения пациентов с ИЛФ, в современном мире предпринимаются активные попытки по разработке эффективных антифибротических средств. Среди доступных терапевтических препаратов, одобренных FDA (Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств) для лечения ИЛФ, известны пирфенидон и нинтеданиб, обладающие антифибротическими свойствами. Однако их применение ограничено из-за большого спектра побочных эффектов.
Для изучения антифибротической активности лекарственных средств используют несколько животных моделей. Введение блеомицина в дыхательные пути мелких грызунов является наиболее часто используемой экспериментальной моделью для изучения патологии ИЛФ и широко используемой доклинической моделью для тестирования потенциальных терапевтических соединений [88, 89]. Показано, что
однократное интратрахеальное введение блеомицина лабораторным мышам вначале приводит к развитию воспалительной фазы заболевания, которая характеризуется увеличением уровня провоспалительных цитокинов в легких, активной инфильтрацией интерстиция альвеол и альвеолярных ходов воспалительными клетками, лейкоцитозом в периферической крови. Это воспаление длится около 7 дней и затем переходит в фиброзную фазу, которая наиболее точно имитирует проявление идиопатического фиброза легких у человека. Данная модель легочного фиброза является стандартной и хорошо охарактеризованной моделью для тестирования лекарственных препаратов с антифибротической активностью [89].
В ходе исследования проводилось изучение влияния препаратов: нинтеданиб в дозе 60 мг/кг/сут, пирфенидон в дозе 300 мг/кг/сут - на развитие блеомицин-индуцированного легочного фиброза у мышей в сравнении с их совместным использованием (60 мг/кг/сут нинтеданиба + 300 мг/кг/сут пирфенидона).
Результаты исследования показали, что в условиях блеомицин-индуцированного пневмофиброза в группах животных, леченных препаратами пирфенидон в дозе 300 мг/кг/сут и нинтеданиб в дозе и 60 мг/кг/сут, снижается масса тела животных, что закономерно при применении данных лекарственных средств, обладающих побочным действием на обмен веществ, последствием которого, в том числе, является снижение аппетита и массы тела. Сочетанное применение препаратов пирфенидон и нинтеданиб вызывает кумуляцию негативного влияния препаратов на данный показатель.
К 23 суткам после однократного введения блеомицина у мышей в легких наблюдаются значительные фибротические изменения. И пирфенидон, и блеомицин при пневмофиброзе снижают интенсивность воспалительной реакции, препятствуют развитию фиброзирующего альвеолита. При политерапии легочного фиброза пирфенидоном и нинтеданибом наблюдаетсся наименьшая противовоспалительная, но наиболее высокая антифибротическая активность.
Анализ признаков воспаления в легочной ткани при действии препаратов на пораженный орган подтверждает местное противовоспалительное действие пирфенидона и, в особенности, нинтеданиба. Данная реакция, вероятно, имеет важное значение в ходе общего механизма, препятствующего нарушению нормальной структуры и функций легких. Дальнейшие исследования в этом направлении позволят выяснить тонкости сложной системы взаимодействия клеток и сигнальных молекул, как при фиброзе, так и при использовании антифибротических средств, и разработать более таргетные методы терапии идиопатического легочного фиброза.
Антифибротическое действие препаратов в условиях моделирования легочного фиброза проявляется в уменьшении площади соединительной ткани в легких мышей и снижении экспрессии профибротических медиаторов (TGF-P1, коллагена I типа, гидроксипролина, гиалуроной кислоты) в легочной ткани. Наибольший эффект на уровень профибротических медиаторов отмечается при введении нинтеданиба. Эти данные, в числе множества других исследований, экспериментальных и клинических, могут послужить материальной базой для формулирования принципов патогенеза ИЛФ и воздействия на него применяемых противофиброзных препаратов.
Таким образом, на основании полученных результатов гистологических исследований и ИФА показано, что исследованные препараты обладают противовоспалительной и антифибротической активностью на блеомицин- индуцированной модели легочного фиброза .
Для изучения антифибротической активности лекарственных средств используют несколько животных моделей. Введение блеомицина в дыхательные пути мелких грызунов является наиболее часто используемой экспериментальной моделью для изучения патологии ИЛФ и широко используемой доклинической моделью для тестирования потенциальных терапевтических соединений [88, 89]. Показано, что
однократное интратрахеальное введение блеомицина лабораторным мышам вначале приводит к развитию воспалительной фазы заболевания, которая характеризуется увеличением уровня провоспалительных цитокинов в легких, активной инфильтрацией интерстиция альвеол и альвеолярных ходов воспалительными клетками, лейкоцитозом в периферической крови. Это воспаление длится около 7 дней и затем переходит в фиброзную фазу, которая наиболее точно имитирует проявление идиопатического фиброза легких у человека. Данная модель легочного фиброза является стандартной и хорошо охарактеризованной моделью для тестирования лекарственных препаратов с антифибротической активностью [89].
В ходе исследования проводилось изучение влияния препаратов: нинтеданиб в дозе 60 мг/кг/сут, пирфенидон в дозе 300 мг/кг/сут - на развитие блеомицин-индуцированного легочного фиброза у мышей в сравнении с их совместным использованием (60 мг/кг/сут нинтеданиба + 300 мг/кг/сут пирфенидона).
Результаты исследования показали, что в условиях блеомицин-индуцированного пневмофиброза в группах животных, леченных препаратами пирфенидон в дозе 300 мг/кг/сут и нинтеданиб в дозе и 60 мг/кг/сут, снижается масса тела животных, что закономерно при применении данных лекарственных средств, обладающих побочным действием на обмен веществ, последствием которого, в том числе, является снижение аппетита и массы тела. Сочетанное применение препаратов пирфенидон и нинтеданиб вызывает кумуляцию негативного влияния препаратов на данный показатель.
К 23 суткам после однократного введения блеомицина у мышей в легких наблюдаются значительные фибротические изменения. И пирфенидон, и блеомицин при пневмофиброзе снижают интенсивность воспалительной реакции, препятствуют развитию фиброзирующего альвеолита. При политерапии легочного фиброза пирфенидоном и нинтеданибом наблюдаетсся наименьшая противовоспалительная, но наиболее высокая антифибротическая активность.
Анализ признаков воспаления в легочной ткани при действии препаратов на пораженный орган подтверждает местное противовоспалительное действие пирфенидона и, в особенности, нинтеданиба. Данная реакция, вероятно, имеет важное значение в ходе общего механизма, препятствующего нарушению нормальной структуры и функций легких. Дальнейшие исследования в этом направлении позволят выяснить тонкости сложной системы взаимодействия клеток и сигнальных молекул, как при фиброзе, так и при использовании антифибротических средств, и разработать более таргетные методы терапии идиопатического легочного фиброза.
Антифибротическое действие препаратов в условиях моделирования легочного фиброза проявляется в уменьшении площади соединительной ткани в легких мышей и снижении экспрессии профибротических медиаторов (TGF-P1, коллагена I типа, гидроксипролина, гиалуроной кислоты) в легочной ткани. Наибольший эффект на уровень профибротических медиаторов отмечается при введении нинтеданиба. Эти данные, в числе множества других исследований, экспериментальных и клинических, могут послужить материальной базой для формулирования принципов патогенеза ИЛФ и воздействия на него применяемых противофиброзных препаратов.
Таким образом, на основании полученных результатов гистологических исследований и ИФА показано, что исследованные препараты обладают противовоспалительной и антифибротической активностью на блеомицин- индуцированной модели легочного фиброза .
