ВВЕДЕНИЕ 3
Цель исследования 4
Научная новизна 4
Практическая значимость 4
Задачи исследования 5
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 5
1.1 Роль тромбоцитов в организме человека 5
1.2 Основные динамические особенности внутриклеточной сигнализации в тромбоцитах 7
1.3 Митохондрии: структура, функции и патологии 14
1.4 Роль кальция в регуляции митохондриальной активности 21
1.5 Аналитические подходы к оценке митохондриального мембранного потенциала 21
1.6 Хронические миелопролиферативные заболевания (ХМПЗ): классификация, причины развития 23
1.7 Особенности функционального состояния тромбоцитов при хронических миелопролиферативных заболеваниях 25
1.8 Проточная цитофлуориметрия в исследовании активности митохондриального ответа 27
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 33
2.1 Использованные материалы: красители, активаторы и растворы 33
2.2 Включение здоровых доноров для контрольной группы 33
2.3 Исследование пациентов с хроническими миелопролиферативными заболеваниями 33
2.4 Проточная цитофлуориметрия 34
2.5 Протокол одновременного исследования внутриклеточной кальциевой сигнализации и митохондриального мембранного потенциала в тромбоцитах 34
2.6 Обработка и анализ данных 37
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 38
3.1 Оптимизация протокола исследования митохондриального потенциала и кальциевого ответа 38
3.2 Чувствительность митохондрий к амплитуде и динамике изменения концентрации кальция в цитозоле 40
3.3 Сравнение чувствительности митохондрий при активации тромбоцитов TRAP-6 и АДФ у здоровых доноров и пациентов с ХМПЗ 54
3.4 Оценка влияния митохондриального разобщителя на коэффициент чувствительности 56
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 62
5. ВЫВОДЫ 64
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 65
Тромбоциты, благодаря их высокой чувствительности к изменениям энергетического обмена и внутриклеточного кальция, служат идеальной моделью для изучения метаболических процессов. Помимо ключевой роли в гемостазе, эти безъядерные элементы крови участвуют в иммунных реакциях и воспалительных ответах, что делает их исследование особенно актуальным [1]. Ключевой особенностью тромбоцитов является их зависимость от митохондриального энергетического обмена - хотя они способны получать энергию за счет гликолиза, процессы активации и агрегации требуют значительных затрат АТФ, образующегося в ходе окислительного фосфорилирования [2]. Особый интерес представляет регуляция ионов Ca²⁺, которые выступают не только вторичными мессенджерами, но и важными модуляторами энергетического метаболизма через активацию ферментов цикла Кребса [3]. В здоровых тромбоцитах митохондрии выполняют двойную функцию: поддерживают мембранный потенциал (Ψ) благодаря работе электрон-транспортной цепи и служат динамическими буферами внутриклеточного кальция, поглощая его избыток через митохондриальный унипортер (MCU)[4]. Кальциевая сигнализация и митохондриальная активность представляют собой взаимосвязанные процессы. Совместный анализ этих систем с помощью новой методики даст возможность по-новому взглянуть на функционирование митохондрий в тромбоцитах.
Цель исследования
Оценить чувствительность митохондрий к концентрации кальция в цитозоле, с помощью проточной цитометрии.
Научная новизна
Настоящая работа вносит значительный вклад в изучение функционального состояния тромбоцитов благодаря разработке нового подхода к одновременному исследованию изменений потенциала митохондриальной мембраны и внутриклеточной концентрации кальция. Хотя традиционные методы микроскопии, такие как конфокальная микроскопия с использованием потенциал-чувствительных красителей (например, JC-1 или TMRM) позволяют визуализировать эти параметры [5], однако, они имеют существенное ограничение - невозможность получения достаточной статистической выборки из-за низкой пропускной способности. В последние годы был предложен метод оценки динамики кальция Δ[Ca²⁺] в тромбоцитах с помощью проточной цитометрии [6], что позволило значительно повысить точность и воспроизводимость измерений.
Практическая значимость
В работе предложен метод одновременного измерения относительного уровня мембранного потенциала митохондрий и уровня кальция в тромбоцитах с помощью непрерывной проточной цитометрии, и проведено сравнение митохондрий тромбоцитов пациентов с хроническими миелопролиферативными заболеваниями (ХМПЗ) со здоровыми донорами.
Задачи исследования
1) Исследовать чувствительность митохондрии к амплитуде и динамике изменения концентрации кальция в цитозоле.
2) Параметризация чувствительности митохондрий тромбоцитов к кальцию (коэффициент чувствительности, К).
3) Оценка влияния митохондриального разобщителя.
4) Сравнение показателей тромбоцитов здоровых доноров и пациентов с хроническими миелопролиферативными заболеваниями.
