ВВЕДЕНИЕ 3
1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 5
1.1 Методы получения наночастиц серебра 6
1.2 Физико-химические свойства наночастиц серебра 8
1.3 Антибактериальные свойства наночастиц серебра 10
1.4 Методы определения антибактериальной активности наночастиц 12
1.4.1 Определение минимальной ингибирующей концентрации 12
1.4.2 Диско-диффузионный метод 13
1.5 Биомедицинское применение наночастиц серебра 15
Выводы по Главе 1 15
2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 17
2.1 Техника безопасности 17
2.2 Техника безопасности при работе с ламинарным боксом 19
2.3 Материалы, реактивы, аппаратура, используемые в работе 20
2.4 Синтез наночастиц серебра 21
2.5 Характеризация наночастиц серебра 22
2.5.1 Просвечивающая электронная микроскопия 22
2.6 Методика определения антибактериальной активности наночастиц серебра 23
2.6.1 Подготовка бактериальных культур 23
2.6.2 Экспресс-методика определения антибактериальной активности наночастиц 24
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 27
3.1 Физико-химические характеристики наночастиц серебра 27
3.2 Определение антибактериальной активности наночастиц серебра стандартным
суспензионным методом 29
3.3 Спектрофотометрическое исследование роста бактерий S.aureus 34
ВЫВОД 40
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 41
В настоящее время проблеме образования новых устойчивых штаммов микроорганизмов уделяется большое внимание [1, 2]. Это связано с тем, что по прогнозам экспертов, при сохранении существующей тенденции к 2050-му году от устойчивых к антибиотикам бактерий будут ежегодно погибать более 10 миллионов человек [3]. Поэтому труды ученых направлены на поиск и разработку новых более эффективных способов подавления жизнедеятельности микроорганизмов [4-7].
Надежным решением проблемы является разработка неорганических наночастиц с антимикробными свойствами, которые не вызывают образования устойчивых бактериальных штаммов. Материалы, обладающие наноструктурой (1-100 нм), отличаются по многим физическим и химическим свойствам от тех же материалов макроскопических размеров. Эти различия заключаются в структурных свойствах наноматериалов, которые обусловлены соотношением площади поверхности к объему. Такие материалы могут найти применение при разработке новых ранозаживляющих медицинских материалов, биорезорбируемых имплантатов, систем доставки лекарств и т.д.
В настоящее время получено большое количество наночастиц с антибактериальной активностью. Среди них наиболее активными являются наночастицы металлов и оксидов металлов, они обладают развитой поверхностью [8], химической стабильностью [9], пролонгированным антимикробным действием [10] и относительной безопасностью [11]. Наночастицы серебра и оксида цинка являются наиболее изученными и исследованными антимикробными агентами с доказанной антимикробной активностью и разрешенные для применения в биомедицинских приложениях. Однако антибактериальная активность наночастиц определяется не только их химическим составом, но и морфологией, методом синтеза, размером, поверхностным зарядом, удельной поверхностью и рядом других факторов.
Для оценки антибактериальной активности агентов в настоящее время применяются суспензионный и диско-диффузионный методы, основанные на оценке роста микроорганизмов в присутствие бактерицида. Однако, данные методы разработаны для химических препаратов, находящихся в растворе в ионной форме, что обеспечивает равномерную диффузию агентов в питательную среду и высокую воспроизводимость применяемых методов. Однако, в случае наночастиц, механизм действия которых часто не связан только с выделением ионов, данные методики часто дают заниженные результаты. Так же методики требуют длительного времени, связанного с предварительным контактом 3
бактерий с наночастицами (от 1 до 24 часов) с последующим посевом суспензии и выращиванием колоний на плотной питательной среде (24 часа для бактерий и 48 часов для грибков).
В связи с этим, целью работы являлась разработка и апробация экспресс-методики спектрофотометрической оценки антибактериальной активности наночастиц в вариации микропланшетного метода.
Для решения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1. Разработать методику, основанную на спектрофотометрической оценке изменения оптической плотности суспензии в процессе бактериального роста бактерий
S.aureus АТСС 6538-Р, который является модельным штаммамом для определения антибиотикочувствительности;
2. Оценить изменение оптической плотности суспензии тестовых бактерий в присутствие наночастиц Ag различной дисперсности, полученных химическим методом (11, 23 нм) и электрическим взрывом проводников (63, 85 нм).
3. Определить диапазон концентраций, размеров наночастиц и бактерий, подходящих для данных исследований;
4. Провести сравнительную оценку результатов антибактериальной активности наночастиц, полученных при помощи экспресс-методики с данными рутинного посева на плотную питательную среду.
Разработанная методика обладает рядом преимуществ, связанных с малым расходом питательных сред (объем лунки микропланшета 200 мкл), быстрой оценкой (не более 6 часов) и высокой воспроизводимостью благодаря возможности проведения большого количества параллельных измерений (один микропланшет содержит 96 лунок).
Однако методика имеет ряд ограничений:
1. Чувствительность ограничена бактериальными суспензиями в концентрации от 107 до 5*108 КОЕ/мл;
2. Это косвенный метод, который оценивает общую биомассу бактерий, то есть как живых, так и мертвых;
3. Ввиду мутности суспензии наночастиц, оптическая плотность бактерий рассчитывается как разность между оптической плотностью в лунке и оптической плотностью контрольной пробы наночастиц (без бактерий).
Таким образом, на основании проведенных исследований, была разработана методика экспресс-оценки антибактериальной активности наночастиц различного размера. Методика предназначена для количественного определения жизнеспособности бактериальной суспензии в присутствии наночастиц размером от 11 до 85 нм.
В основе методики лежит спектрофотометрический метод, основанный на измерении оптической плотности бактериальной культуры в бульоне через 6 часов экспозиции с наночастицами. Повышенная мутность свыше 0,056 отн. ед. является индикатором роста бактерий, так как мутность прямо пропорциональна количеству клеток. Эта методика является быстрой (6 часов) по сравнению со стандартным суспензионным методом с подсчетом на чашках.
