Разработка методики определения алкалоидов чемерицы в биологических объектах и лекарственных препаратах методом ВЭЖХ-МС/МС
|
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13
1.1. Характеристика представителей рода Чемерица 13
1.2. Физико-химические свойства основных алкалоидов чемерицы 19
1.3. Токсикология алкалоидов чемерицы 23
1.4. Отравления чемерицей 25
1.5. Методики обнаружения алкалоидов чемерицы в биологических объектах и
лекарственных препаратах 27
ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 38
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 39
2.1. Оборудование 39
2.2. Реактивы 40
2.3. Исследуемые образцы 41
2.4. Приготовление исходных и рабочих стандартных растворов 41
2.5. Статистическая и математическая обработка результатов исследования 42
2.6. Дизайн исследования по моделированию острого отравления лекарственным
препаратом «Чемеричная вода» 43
ГЛАВА 3. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 45
3.1. Статистический анализ острых отравлений чемерицей 45
3.2. Разработка методики определения алкалоидов чемерицы методом ВЭЖХ-
МС/МС 51
3.2.1. Выбор основных алкалоидов в составе лекарственного препарата
«Чемеричная вода» 51
3.2.2. Оптимизация параметров масс-спектрометрического детектирования 53
3.2.3. Подбор условий для хроматографического разделения аналитов 55
3.3. Разработка методики количественного определения индивидуального алкалоида для контроля качества лекарственного препарата «Чемеричная вода» 60
3.3.1. Выбор основного алкалоида для проведения количественного определения 60
3.3.2. Разработка методики количественного определения иервина методом
ВЭЖХ-ДАД 63
3.3.3. Валидация методики количественного определения иервина методом
ВЭЖХ-ДАД 67
3.3.4. Определение концентрации иервина в исследуемых образцах
лекарственного препарата «Чемеричная вода» 70
3.4. Разработка и валидация методики количественного определения иервина и
протовератрина А в биологических объектах методом ВЭЖХ-МС/МС 71
3.4.1. Разработка методики количественного определения алкалоидов чемерицы в
биологических объектах 71
3.4.2. Валидация методики количественного определения иервина и
протовератрина А в плазме крови и моче 74
3.4.2.1. Селективность 74
3.4.2.2. Линейность 79
3.4.2.3. Нижний предел количественного определения 83
3.4.2.4. Перенос пробы 83
3.4.2.5. Точность и прецизионность 84
3.4.2.6. Степень извлечения 86
3.4.2.7. Матричный эффект 87
3.4.2.8. Стабильность 88
3.4.3. Валидация методики для количественного определения иервина и
протовератрина А в плазме крови в расширенном диапазоне концентраций 90
3.4.3.1. Линейность 90
3.4.3.2. Нижний предел количественного определения 92
3.4.3.3. Перенос пробы 92
3.4.3.4. Точность и прецизионность 93
ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 94
ГЛАВА 4. АПРОБАЦИЯ ВАЛИДИРОВАННОЙ МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛКАЛОИДОВ ЧЕМЕРИЦЫ МЕТОДОМ ВЭЖХ-МС/МС НА
БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ 96
4.1. Случаи отравления алкалоидами чемерицы в г. Москве 96
4.2. Моделирование острого отравления лекарственным препаратом «Чемеричная
вода» на лабораторных животных 107
ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 108
ОБЩИЕ ВЫВОДЫ 109
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 110
ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ 110
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 111
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 113
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13
1.1. Характеристика представителей рода Чемерица 13
1.2. Физико-химические свойства основных алкалоидов чемерицы 19
1.3. Токсикология алкалоидов чемерицы 23
1.4. Отравления чемерицей 25
1.5. Методики обнаружения алкалоидов чемерицы в биологических объектах и
лекарственных препаратах 27
ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 38
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 39
2.1. Оборудование 39
2.2. Реактивы 40
2.3. Исследуемые образцы 41
2.4. Приготовление исходных и рабочих стандартных растворов 41
2.5. Статистическая и математическая обработка результатов исследования 42
2.6. Дизайн исследования по моделированию острого отравления лекарственным
препаратом «Чемеричная вода» 43
ГЛАВА 3. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 45
3.1. Статистический анализ острых отравлений чемерицей 45
3.2. Разработка методики определения алкалоидов чемерицы методом ВЭЖХ-
МС/МС 51
3.2.1. Выбор основных алкалоидов в составе лекарственного препарата
«Чемеричная вода» 51
3.2.2. Оптимизация параметров масс-спектрометрического детектирования 53
3.2.3. Подбор условий для хроматографического разделения аналитов 55
3.3. Разработка методики количественного определения индивидуального алкалоида для контроля качества лекарственного препарата «Чемеричная вода» 60
3.3.1. Выбор основного алкалоида для проведения количественного определения 60
3.3.2. Разработка методики количественного определения иервина методом
ВЭЖХ-ДАД 63
3.3.3. Валидация методики количественного определения иервина методом
ВЭЖХ-ДАД 67
3.3.4. Определение концентрации иервина в исследуемых образцах
лекарственного препарата «Чемеричная вода» 70
3.4. Разработка и валидация методики количественного определения иервина и
протовератрина А в биологических объектах методом ВЭЖХ-МС/МС 71
3.4.1. Разработка методики количественного определения алкалоидов чемерицы в
биологических объектах 71
3.4.2. Валидация методики количественного определения иервина и
протовератрина А в плазме крови и моче 74
3.4.2.1. Селективность 74
3.4.2.2. Линейность 79
3.4.2.3. Нижний предел количественного определения 83
3.4.2.4. Перенос пробы 83
3.4.2.5. Точность и прецизионность 84
3.4.2.6. Степень извлечения 86
3.4.2.7. Матричный эффект 87
3.4.2.8. Стабильность 88
3.4.3. Валидация методики для количественного определения иервина и
протовератрина А в плазме крови в расширенном диапазоне концентраций 90
3.4.3.1. Линейность 90
3.4.3.2. Нижний предел количественного определения 92
3.4.3.3. Перенос пробы 92
3.4.3.4. Точность и прецизионность 93
ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 94
ГЛАВА 4. АПРОБАЦИЯ ВАЛИДИРОВАННОЙ МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛКАЛОИДОВ ЧЕМЕРИЦЫ МЕТОДОМ ВЭЖХ-МС/МС НА
БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ 96
4.1. Случаи отравления алкалоидами чемерицы в г. Москве 96
4.2. Моделирование острого отравления лекарственным препаратом «Чемеричная
вода» на лабораторных животных 107
ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 108
ОБЩИЕ ВЫВОДЫ 109
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 110
ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ 110
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 111
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 113
Актуальность темы исследования
На всех этапах развития человеческой цивилизации изучение растений, содержащих в своем составе биологически активные вещества, представляло особый интерес и большую практическую ценность вследствие возможности их использования в медицинских целях [1-6]. Однако некоторые из растений содержат токсины, вырабатываемые для защиты от различных угроз, таких как бактерии, грибы, насекомые, а также животные и люди, которые могут их употребить в пищу [7]. Ежегодно по всему миру происходят сотни тысяч отравлений ядовитыми растениями и, по мнению ряда ученых, отравления растениями являются незаслуженно обойдённой вниманием областью аналитической токсикологии [8-23]. К таким растениям относятся и представители рода Чемерица (Veratrum).
Различные виды чемерицы широко распространены в Северном полушарии: они встречаются в Европе, на всей территории РФ, в Китае, Японии и Корее, а также в Северной Америке [24-27]. Все представители рода Чемерица ядовиты, так как содержат в своем составе токсичные алкалоиды [28]. Ошибочное употребление данного растения приводит к отравлению, требующему оказания специализированной медицинской помощи [29]. Особую актуальность данная проблема представляет в РФ вследствие того, что лекарственное растительное сырье (ЛРС) «Чемерицы Лобеля корневища с корнями» (Veratri Lobeliani rhizomata cum radicibus) представлено в Государственной Фармакопее XIV издания [30]. Из данного ЛРС производится лекарственный препарат «Чемеричная вода», предназначенный для наружного применения в качестве противопедикулезного средства [31]. Однако в нашей стране чемерицу также используют в качестве «средства народной медицины» для лечения алкоголизма в домашних условиях [32-34]. Зачастую родственники больного или сам больной прибегают к такой мере, не осознавая последствий возможного отравления алкалоидами чемерицы.
В настоящее время в практике химико-токсикологических лабораторий и бюро судебно-медицинской экспертизы отсутствует методологический подход к лабораторной диагностике отравлений алкалоидами чемерицы. Лабораторная диагностика не проводится вследствие того, что алкалоиды чемерицы присутствуют в биологических образцах в крайне низких количествах (на уровне сотен пг/мл). Детектирование следовых количеств алкалоидов требует разработки высокочувствительной и селективной методики при помощи инструментальных методов анализа. На сегодняшний день в РФ постановка диагноза отравления в абсолютном большинстве случаев основывается лишь на анамнестических данных. Вследствие схожей картины острого отравления чемерицей с некоторыми другими состояниями, клиническая диагностика не всегда осуществляется верно, что препятствует своевременному оказанию специализированной медицинской помощи [26, 32, 34]. В этой связи разработка и валидация методики определения алкалоидов чемерицы в различных биологических объектах с целью диагностики отравления данным растением или лекарственными препаратами на его основе представляется актуальной. Внедрение такой методики в лабораторную практику повысит выявляемость случаев отравления алкалоидами чемерицы. Отдельный интерес представляет изучение алкалоидного состава самих лекарственных препаратов из ЛРС «Чемерицы Лобеля корневища с корнями», что может быть использовано при проведении контроля их качества на основе содержания индивидуальных биологически активных веществ.
Степень разработанности темы исследования
В современной отечественной литературе отсутствует статистический анализ отравлений алкалоидами чемерицы, а упомянутое в некоторых исследованиях число пострадавших не позволяет судить о масштабе проблемы. В доступной литературе не описаны валидированные методики лабораторной диагностики отравлений чемерицей Лобеля при помощи высокочувствительных и специфичных инструментальных методов анализа. Помимо этого, остается малоизученным алкалоидный состав лекарственных препаратов на основе чемерицы Лобеля. Селективные и чувствительные методики количественного определения действующих веществ в составе лекарственных препаратов при помощи инструментальных методов анализа в настоящее время также не представлены.
Цель исследования
Целью настоящего исследования является разработка и валидация методики качественного и количественного определения алкалоидов чемерицы методом ВЭЖХ-МС/МС в биологических образцах (плазма крови и моча) для лабораторной диагностики отравлений чемерицей, а также в лекарственных препаратах на основе чемерицы Лобеля для проведения контроля качества.
Задачи исследования
1. На основе анализа литературных данных охарактеризовать растения рода Чемерица, их алкалоидный состав, токсические свойства, а также проанализировать описанные в литературе методики определения алкалоидов чемерицы в биологических объектах, лекарственном растительном сырье.
2. Провести статистический анализ отравлений чемерицей в различных регионах РФ за последние несколько лет.
3. Разработать методику определения основных алкалоидов чемерицы Лобеля в биологических образцах и лекарственных препаратах методом ВЭЖХ- МС/МС.
4. Разработать и валидировать методику количественного определения основного алкалоида в составе лекарственного препарата «Чемеричная вода» методом ВЭЖХ-ДАД, а также определить содержание выбранного алкалоида в испытуемых образцах данного лекарственного препарата.
5. Провести валидацию методики количественного определения основных алкалоидов чемерицы Лобеля в биологических объектах (плазма крови и моча) методом ВЭЖХ-МС/МС.
6. Апробировать разработанную методику ВЭЖХ-МС/МС анализа в лабораторной диагностике отравлений чемерицей на биологических образцах, полученных от пострадавших в результате отравления чемерицей, а также от лабораторных животных при моделировании острого отравления лекарственным препаратом «Чемеричная вода».
Научная новизна
Впервые разработана методика идентификации основных алкалоидов чемерицы Лобеля (иервина, протовератрина А и протовератрина В) в биологических образцах (плазма крови, моча) и лекарственных препаратах методом ВЭЖХ-МС/МС, отличающаяся высокой чувствительностью и селективностью. Изучен алкалоидный состав лекарственного препарата «Чемеричная вода». Разработана и валидирована методика количественного определения иервина, превалирующего алкалоида в составе лекарственного препарата «Чемеричная вода», методом ВЭЖХ-ДАД, которая может быть предложена для контроля качества данного препарата. Разработана простая и быстрая методика пробоподготовки для извлечения алкалоидов чемерицы из плазмы крови и мочи. Валидирована методика количественного определения иервина и протовератрина А в биологических образцах методом ВЭЖХ-МС/МС. При помощи валидированной методики впервые описан профиль элиминации иервина, протовератринов А и В в организме человека при остром отравлении алкалоидами чемерицы в процессе проводимого лечения.
Теоретическая и практическая значимость
В процессе работы проведен статистический анализ острых отравлений чемерицей в 5 регионах РФ (г. Москва, г. Санкт-Петербург, г. Омск, г. Чита, ХМАО-Югра) за период 2014-2018 гг. Доказана актуальность изучения проблемы отравлений алкалоидами чемерицы.
Результаты диссертационной работы имеют практическую значимость для врачей-токсикологов, проводящих лечение в случае отравления алкалоидами чемерицы, а также для врачей клинико-лабораторной диагностики и химиков- экспертов, выполняющих химико-токсикологическую диагностику острых отравлений. В результате внедрения лабораторной диагностики отравлений алкалоидами чемерицы в практику Отделения острых отравлений и соматопсихиатрических расстройств ГБУЗ «НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского ДЗМ» был изменен алгоритм постановки диагноза. Лабораторный мониторинг динамики выведения алкалоидов чемерицы из организма пострадавших позволил контролировать эффективность проводимого лечения.
Основные положения, выносимые на защиту:
- Разработанная методика определения иервина, протовератрина А и протовератрина В в биологических образцах и лекарственных препаратах методом ВЭЖХ-МС/МС.
- Разработанная и валидированная методика количественного определения иервина в составе лекарственного препарата «Чемеричная вода» методом ВЭЖХ-ДАД.
- Результаты валидации методики количественного определения иервина и протовератрина А в плазме крови и моче методом ВЭЖХ-МС/МС по следующим параметрам: селективность, нижний предел количественного определения, линейность, перенос пробы, точность, прецизионность, эффект матрицы, степень извлечения, стабильность.
- Результаты определения иервина, протовератрина А и протовератрина В в биологических образцах пациентов с острым отравлением чемерицей, а также в плазме крови крыс, которым вводился лекарственный препарат «Чемеричная вода» для моделирования острого отравления.
Методология и методы исследования
Методология проведенного исследования заключалась в анализе и обобщении литературных данных по теме работы, оценке актуальности темы исследования и степени ее разработанности. Выбор методов анализа основывался на задачах, которые требовалось решать для достижения поставленной цели исследования. Базовым методом работы послужил метод ВЭЖХ с различными видами детектирования (ВЭЖХ-МС/МС, ВЭЖХ-ДАД) в сочетании с программным обеспечением Agilent MassHunter Workstation Software версия B.09.00, Agilent OpenLAB CDS ChemStation Edition версия C.01.04.
Статистическая обработка результатов исследования осуществлялась в программном обеспечении RStudio версия 1.1.414 и Microsoft Excel 2019.
Достоверность научных положений и выводов
Использованное в процессе работы испытательное и вспомогательное оборудование зарегистрировано в Государственном Реестре средств измерений и имеет действительные свидетельства о поверке. Все первичные данные, полученные при помощи инструментальных методов анализа (ВЭЖХ-МС/МС, ВЭЖХ-ДАД), являются достоверными. Разработанные методики количественного определения алкалоидов чемерицы удовлетворяют критериям приемлемости соответствующих валидационных руководств.
Апробация результатов исследования
Основные положения и результаты работы доложены на 41 Конгрессе Европейской Ассоциации Центров Острых Отравлений и Клинических Токсикологов (41st EAPCCT Congress, онлайн, 2021 г.), III международной научной конференции «IPharmS Annual Conference» (Иран, 2021 г.), I Международном симпозиуме «2020 China-Russia Young Scholars Symposium» (г. Москва, 2020 г.).
Диссертационная работа была апробирована 17 февраля 2021 года на межкафедральном заседании Института фармации им. А.П. Нелюбина ФГАУО ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет).
Личный вклад автора
Автору принадлежит ведущая роль в планировании и выполнении экспериментальных исследований, а также в анализе, обобщении и публикации их результатов. Автором лично проведена разработка, валидация, а также экспериментальная апробация методик определения алкалоидов чемерицы в биологических объектах и лекарственных препаратах методом ВЭЖХ (ВЭЖХ- МС/МС, ВЭЖХ-ДАД). Непосредственно автором проведена лабораторная диагностика острых отравлений чемерицей у пациентов, госпитализированных в НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского, а также иные лечебно-
11
профилактические учреждения г. Москвы за период выполнения
диссертационной работы.
Внедрение результатов исследования
Разработанная и валидированная методика определения алкалоидов чемерицы в плазме крови и моче внедрена в практику Отделения острых отравлений и соматопсихиатрических расстройств ГБУЗ «НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского ДЗМ», а также в работу Химико-токсикологической лаборатории Референс-центра по мониторингу потребления ПАВ (филиал) ГБУЗ «МНПЦ наркологии ДЗМ». Материалы, полученные при выполнении диссертационной работы, используются в учебном процессе на кафедре фармацевтической и токсикологической химии им. А.П. Арзамасцева Института Фармации им. А.П. Нелюбина ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет).
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки
Диссертационная работа проводилась в соответствии с тематикой и планом научно-исследовательской работы на кафедре фармацевтической и токсикологической химии им. А.П. Арзамасцева ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), по следующей теме: «Совершенствование образовательных технологий додипломного и последипломного медицинского и фармацевтического образования». Номер государственной регистрации 01.2.011.68237.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 «Фармацевтическая химия, фармакогнозия». Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 4 и 6 паспорта специальности.
Объем и структура диссертации
Работа изложена на 122 страницах машинописного текста, состоит из оглавления, введения, обзора литературы, трех глав с описанием проведенных
экспериментальных исследований и апробации разработанных методик, общих выводов, списка сокращений и списка литературы. Список использованной литературы включает 101 источник, из них 78 - на иностранном языке. Диссертационная работа содержит 24 рисунка и 25 таблиц.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них 4 статьи в изданиях, индексируемых в международных базах данных (Scopus, Web of Science, Chemical Abstracts), 1 статья - в издании квартиля Q1 (Scopus), 2 - в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.
На всех этапах развития человеческой цивилизации изучение растений, содержащих в своем составе биологически активные вещества, представляло особый интерес и большую практическую ценность вследствие возможности их использования в медицинских целях [1-6]. Однако некоторые из растений содержат токсины, вырабатываемые для защиты от различных угроз, таких как бактерии, грибы, насекомые, а также животные и люди, которые могут их употребить в пищу [7]. Ежегодно по всему миру происходят сотни тысяч отравлений ядовитыми растениями и, по мнению ряда ученых, отравления растениями являются незаслуженно обойдённой вниманием областью аналитической токсикологии [8-23]. К таким растениям относятся и представители рода Чемерица (Veratrum).
Различные виды чемерицы широко распространены в Северном полушарии: они встречаются в Европе, на всей территории РФ, в Китае, Японии и Корее, а также в Северной Америке [24-27]. Все представители рода Чемерица ядовиты, так как содержат в своем составе токсичные алкалоиды [28]. Ошибочное употребление данного растения приводит к отравлению, требующему оказания специализированной медицинской помощи [29]. Особую актуальность данная проблема представляет в РФ вследствие того, что лекарственное растительное сырье (ЛРС) «Чемерицы Лобеля корневища с корнями» (Veratri Lobeliani rhizomata cum radicibus) представлено в Государственной Фармакопее XIV издания [30]. Из данного ЛРС производится лекарственный препарат «Чемеричная вода», предназначенный для наружного применения в качестве противопедикулезного средства [31]. Однако в нашей стране чемерицу также используют в качестве «средства народной медицины» для лечения алкоголизма в домашних условиях [32-34]. Зачастую родственники больного или сам больной прибегают к такой мере, не осознавая последствий возможного отравления алкалоидами чемерицы.
В настоящее время в практике химико-токсикологических лабораторий и бюро судебно-медицинской экспертизы отсутствует методологический подход к лабораторной диагностике отравлений алкалоидами чемерицы. Лабораторная диагностика не проводится вследствие того, что алкалоиды чемерицы присутствуют в биологических образцах в крайне низких количествах (на уровне сотен пг/мл). Детектирование следовых количеств алкалоидов требует разработки высокочувствительной и селективной методики при помощи инструментальных методов анализа. На сегодняшний день в РФ постановка диагноза отравления в абсолютном большинстве случаев основывается лишь на анамнестических данных. Вследствие схожей картины острого отравления чемерицей с некоторыми другими состояниями, клиническая диагностика не всегда осуществляется верно, что препятствует своевременному оказанию специализированной медицинской помощи [26, 32, 34]. В этой связи разработка и валидация методики определения алкалоидов чемерицы в различных биологических объектах с целью диагностики отравления данным растением или лекарственными препаратами на его основе представляется актуальной. Внедрение такой методики в лабораторную практику повысит выявляемость случаев отравления алкалоидами чемерицы. Отдельный интерес представляет изучение алкалоидного состава самих лекарственных препаратов из ЛРС «Чемерицы Лобеля корневища с корнями», что может быть использовано при проведении контроля их качества на основе содержания индивидуальных биологически активных веществ.
Степень разработанности темы исследования
В современной отечественной литературе отсутствует статистический анализ отравлений алкалоидами чемерицы, а упомянутое в некоторых исследованиях число пострадавших не позволяет судить о масштабе проблемы. В доступной литературе не описаны валидированные методики лабораторной диагностики отравлений чемерицей Лобеля при помощи высокочувствительных и специфичных инструментальных методов анализа. Помимо этого, остается малоизученным алкалоидный состав лекарственных препаратов на основе чемерицы Лобеля. Селективные и чувствительные методики количественного определения действующих веществ в составе лекарственных препаратов при помощи инструментальных методов анализа в настоящее время также не представлены.
Цель исследования
Целью настоящего исследования является разработка и валидация методики качественного и количественного определения алкалоидов чемерицы методом ВЭЖХ-МС/МС в биологических образцах (плазма крови и моча) для лабораторной диагностики отравлений чемерицей, а также в лекарственных препаратах на основе чемерицы Лобеля для проведения контроля качества.
Задачи исследования
1. На основе анализа литературных данных охарактеризовать растения рода Чемерица, их алкалоидный состав, токсические свойства, а также проанализировать описанные в литературе методики определения алкалоидов чемерицы в биологических объектах, лекарственном растительном сырье.
2. Провести статистический анализ отравлений чемерицей в различных регионах РФ за последние несколько лет.
3. Разработать методику определения основных алкалоидов чемерицы Лобеля в биологических образцах и лекарственных препаратах методом ВЭЖХ- МС/МС.
4. Разработать и валидировать методику количественного определения основного алкалоида в составе лекарственного препарата «Чемеричная вода» методом ВЭЖХ-ДАД, а также определить содержание выбранного алкалоида в испытуемых образцах данного лекарственного препарата.
5. Провести валидацию методики количественного определения основных алкалоидов чемерицы Лобеля в биологических объектах (плазма крови и моча) методом ВЭЖХ-МС/МС.
6. Апробировать разработанную методику ВЭЖХ-МС/МС анализа в лабораторной диагностике отравлений чемерицей на биологических образцах, полученных от пострадавших в результате отравления чемерицей, а также от лабораторных животных при моделировании острого отравления лекарственным препаратом «Чемеричная вода».
Научная новизна
Впервые разработана методика идентификации основных алкалоидов чемерицы Лобеля (иервина, протовератрина А и протовератрина В) в биологических образцах (плазма крови, моча) и лекарственных препаратах методом ВЭЖХ-МС/МС, отличающаяся высокой чувствительностью и селективностью. Изучен алкалоидный состав лекарственного препарата «Чемеричная вода». Разработана и валидирована методика количественного определения иервина, превалирующего алкалоида в составе лекарственного препарата «Чемеричная вода», методом ВЭЖХ-ДАД, которая может быть предложена для контроля качества данного препарата. Разработана простая и быстрая методика пробоподготовки для извлечения алкалоидов чемерицы из плазмы крови и мочи. Валидирована методика количественного определения иервина и протовератрина А в биологических образцах методом ВЭЖХ-МС/МС. При помощи валидированной методики впервые описан профиль элиминации иервина, протовератринов А и В в организме человека при остром отравлении алкалоидами чемерицы в процессе проводимого лечения.
Теоретическая и практическая значимость
В процессе работы проведен статистический анализ острых отравлений чемерицей в 5 регионах РФ (г. Москва, г. Санкт-Петербург, г. Омск, г. Чита, ХМАО-Югра) за период 2014-2018 гг. Доказана актуальность изучения проблемы отравлений алкалоидами чемерицы.
Результаты диссертационной работы имеют практическую значимость для врачей-токсикологов, проводящих лечение в случае отравления алкалоидами чемерицы, а также для врачей клинико-лабораторной диагностики и химиков- экспертов, выполняющих химико-токсикологическую диагностику острых отравлений. В результате внедрения лабораторной диагностики отравлений алкалоидами чемерицы в практику Отделения острых отравлений и соматопсихиатрических расстройств ГБУЗ «НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского ДЗМ» был изменен алгоритм постановки диагноза. Лабораторный мониторинг динамики выведения алкалоидов чемерицы из организма пострадавших позволил контролировать эффективность проводимого лечения.
Основные положения, выносимые на защиту:
- Разработанная методика определения иервина, протовератрина А и протовератрина В в биологических образцах и лекарственных препаратах методом ВЭЖХ-МС/МС.
- Разработанная и валидированная методика количественного определения иервина в составе лекарственного препарата «Чемеричная вода» методом ВЭЖХ-ДАД.
- Результаты валидации методики количественного определения иервина и протовератрина А в плазме крови и моче методом ВЭЖХ-МС/МС по следующим параметрам: селективность, нижний предел количественного определения, линейность, перенос пробы, точность, прецизионность, эффект матрицы, степень извлечения, стабильность.
- Результаты определения иервина, протовератрина А и протовератрина В в биологических образцах пациентов с острым отравлением чемерицей, а также в плазме крови крыс, которым вводился лекарственный препарат «Чемеричная вода» для моделирования острого отравления.
Методология и методы исследования
Методология проведенного исследования заключалась в анализе и обобщении литературных данных по теме работы, оценке актуальности темы исследования и степени ее разработанности. Выбор методов анализа основывался на задачах, которые требовалось решать для достижения поставленной цели исследования. Базовым методом работы послужил метод ВЭЖХ с различными видами детектирования (ВЭЖХ-МС/МС, ВЭЖХ-ДАД) в сочетании с программным обеспечением Agilent MassHunter Workstation Software версия B.09.00, Agilent OpenLAB CDS ChemStation Edition версия C.01.04.
Статистическая обработка результатов исследования осуществлялась в программном обеспечении RStudio версия 1.1.414 и Microsoft Excel 2019.
Достоверность научных положений и выводов
Использованное в процессе работы испытательное и вспомогательное оборудование зарегистрировано в Государственном Реестре средств измерений и имеет действительные свидетельства о поверке. Все первичные данные, полученные при помощи инструментальных методов анализа (ВЭЖХ-МС/МС, ВЭЖХ-ДАД), являются достоверными. Разработанные методики количественного определения алкалоидов чемерицы удовлетворяют критериям приемлемости соответствующих валидационных руководств.
Апробация результатов исследования
Основные положения и результаты работы доложены на 41 Конгрессе Европейской Ассоциации Центров Острых Отравлений и Клинических Токсикологов (41st EAPCCT Congress, онлайн, 2021 г.), III международной научной конференции «IPharmS Annual Conference» (Иран, 2021 г.), I Международном симпозиуме «2020 China-Russia Young Scholars Symposium» (г. Москва, 2020 г.).
Диссертационная работа была апробирована 17 февраля 2021 года на межкафедральном заседании Института фармации им. А.П. Нелюбина ФГАУО ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет).
Личный вклад автора
Автору принадлежит ведущая роль в планировании и выполнении экспериментальных исследований, а также в анализе, обобщении и публикации их результатов. Автором лично проведена разработка, валидация, а также экспериментальная апробация методик определения алкалоидов чемерицы в биологических объектах и лекарственных препаратах методом ВЭЖХ (ВЭЖХ- МС/МС, ВЭЖХ-ДАД). Непосредственно автором проведена лабораторная диагностика острых отравлений чемерицей у пациентов, госпитализированных в НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского, а также иные лечебно-
11
профилактические учреждения г. Москвы за период выполнения
диссертационной работы.
Внедрение результатов исследования
Разработанная и валидированная методика определения алкалоидов чемерицы в плазме крови и моче внедрена в практику Отделения острых отравлений и соматопсихиатрических расстройств ГБУЗ «НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского ДЗМ», а также в работу Химико-токсикологической лаборатории Референс-центра по мониторингу потребления ПАВ (филиал) ГБУЗ «МНПЦ наркологии ДЗМ». Материалы, полученные при выполнении диссертационной работы, используются в учебном процессе на кафедре фармацевтической и токсикологической химии им. А.П. Арзамасцева Института Фармации им. А.П. Нелюбина ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет).
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки
Диссертационная работа проводилась в соответствии с тематикой и планом научно-исследовательской работы на кафедре фармацевтической и токсикологической химии им. А.П. Арзамасцева ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), по следующей теме: «Совершенствование образовательных технологий додипломного и последипломного медицинского и фармацевтического образования». Номер государственной регистрации 01.2.011.68237.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 «Фармацевтическая химия, фармакогнозия». Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 4 и 6 паспорта специальности.
Объем и структура диссертации
Работа изложена на 122 страницах машинописного текста, состоит из оглавления, введения, обзора литературы, трех глав с описанием проведенных
экспериментальных исследований и апробации разработанных методик, общих выводов, списка сокращений и списка литературы. Список использованной литературы включает 101 источник, из них 78 - на иностранном языке. Диссертационная работа содержит 24 рисунка и 25 таблиц.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них 4 статьи в изданиях, индексируемых в международных базах данных (Scopus, Web of Science, Chemical Abstracts), 1 статья - в издании квартиля Q1 (Scopus), 2 - в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.
1. На основании критического анализа зарубежной и отечественной научной литературы приведена общая характеристика представителей рода Чемерица, описаны физико-химические и токсические свойства основных алкалоидов чемерицы, оценена возможность использования метода ВЭЖХ для целей биоаналитики и контроля качества лекарственного препарата «Чемеричная вода».
2. По результатам статистического анализа отравлений чемерицей в пяти регионах РФ (г. Москва, г. Санкт-Петербург, г. Омск, г. Чита, ХМАО-Югра) за 2014-2018 гг. доказана актуальность разработки биоаналитической методики для диагностики отравлений алкалоидами чемерицы.
3. Разработана методика хроматографического разделения и тандемного масс-спектрометрического детектирования трех основных алкалоидов чемерицы Лобеля (иервин, протовератрин А, протовератрин В).
4. Разработана и валидирована методика количественного определения иервина методом ВЭЖХ-ДАД, которая может быть использована при проведении контроля качества лекарственного препарата «Чемеричная вода». Содержание иервина в испытуемых образцах лекарственного препарата «Чемеричная вода» находилось в диапазоне от 136 до 170 мкг/мл.
5. Валидирована методика количественного определения иервина и протовератрина А в плазме крови и моче методом ВЭЖХ-МС/МС. Методика соответствовала всем валидационным критериям, указанным в руководствах по валидации биоаналитических методик. Нижний предел количественного определения методики как для иервина, так и для протовератрина А составил 0,1 нг/мл в плазме крови и моче.
6. Разработанная и валидированная методика определения алкалоидов чемерицы в биологических образцах была апробирована для лабораторного подтверждения случаев острого отравления алкалоидами чемерицы в г. Москве. Данная методика также была апробирована на образцах плазмы крови, полученных при моделировании острого отравления лекарственным препаратом «Чемеричная вода» на лабораторных животных.
2. По результатам статистического анализа отравлений чемерицей в пяти регионах РФ (г. Москва, г. Санкт-Петербург, г. Омск, г. Чита, ХМАО-Югра) за 2014-2018 гг. доказана актуальность разработки биоаналитической методики для диагностики отравлений алкалоидами чемерицы.
3. Разработана методика хроматографического разделения и тандемного масс-спектрометрического детектирования трех основных алкалоидов чемерицы Лобеля (иервин, протовератрин А, протовератрин В).
4. Разработана и валидирована методика количественного определения иервина методом ВЭЖХ-ДАД, которая может быть использована при проведении контроля качества лекарственного препарата «Чемеричная вода». Содержание иервина в испытуемых образцах лекарственного препарата «Чемеричная вода» находилось в диапазоне от 136 до 170 мкг/мл.
5. Валидирована методика количественного определения иервина и протовератрина А в плазме крови и моче методом ВЭЖХ-МС/МС. Методика соответствовала всем валидационным критериям, указанным в руководствах по валидации биоаналитических методик. Нижний предел количественного определения методики как для иервина, так и для протовератрина А составил 0,1 нг/мл в плазме крови и моче.
6. Разработанная и валидированная методика определения алкалоидов чемерицы в биологических образцах была апробирована для лабораторного подтверждения случаев острого отравления алкалоидами чемерицы в г. Москве. Данная методика также была апробирована на образцах плазмы крови, полученных при моделировании острого отравления лекарственным препаратом «Чемеричная вода» на лабораторных животных.
