ИССЛЕДОВАНИЕ ДИФФУЗИИ РАСТВОРА АЛЬБУМИНА В КОЖУ МЕТОДОМ ДВУХФОТОННОЙ МИКРОСКОПИИ
|
ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 6
ВВЕДЕНИЕ 7
1 Нелинейная микроскопия 9
1.1 Флуоресценция 11
1.2 Двухфотонное возбуждение флуоресценции 12
1.3 Время жизни флуоресценции. Квантовый выход 14
1.4 Генерация второй гармоники 16
1.5 Метод время - коррелированного счета единичных фотонов TCSCP (Time-
Correlated Single Photon Counting) 17
2 Многофотонный микроскоп JenLab Microscope MPTflex10 21
2.1 Характеристика прибора 21
2.2 Принцип работы прибора 22
2.3 Фемтосекундный лазер Mai Tai XF 1 25
2.4 Фокусирующая оптика 26
2.5 Программное обеспечение SPCimage 26
3 Кожа 30
3.1 Строение кожи 30
3.2 Эластические и коллагеновые волокна дермы 31
3.3 Источники автофлуоресценции и оптических гармоник 34
4 Альбумин 37
5 Методика эксперимента 40
6 Результаты 42
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 48
ЛИТЕРАТУРА 49
ВВЕДЕНИЕ 7
1 Нелинейная микроскопия 9
1.1 Флуоресценция 11
1.2 Двухфотонное возбуждение флуоресценции 12
1.3 Время жизни флуоресценции. Квантовый выход 14
1.4 Генерация второй гармоники 16
1.5 Метод время - коррелированного счета единичных фотонов TCSCP (Time-
Correlated Single Photon Counting) 17
2 Многофотонный микроскоп JenLab Microscope MPTflex10 21
2.1 Характеристика прибора 21
2.2 Принцип работы прибора 22
2.3 Фемтосекундный лазер Mai Tai XF 1 25
2.4 Фокусирующая оптика 26
2.5 Программное обеспечение SPCimage 26
3 Кожа 30
3.1 Строение кожи 30
3.2 Эластические и коллагеновые волокна дермы 31
3.3 Источники автофлуоресценции и оптических гармоник 34
4 Альбумин 37
5 Методика эксперимента 40
6 Результаты 42
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 48
ЛИТЕРАТУРА 49
Методы, основанные на многофотонной микроскопии (МФМ) - являются эффективным инструментом биофотоники, который позволяет оценить состояния кожных покровов и слизистых [1-12]. Данные методы позволяют обеспечить быструю и самое важное неинвазивную диагностику высокой точности, сокращая время исследования и уменьшая вероятность ошибки, связанной с человеческим фактором. Многофотонная микроскопия, как оптический метод диагностики, позволяет изучать процессы в живых организмах и их тканях на молекулярном и клеточном уровне [3,6,9,12]. Преимущества данного метода и способы его применения описываются во многих научных трудах как Российских, так и зарубежных авторов [1, 3, 5, 7]. Метод МФМ имеет большие перспективы в диагностике и изучении злокачественных новообразований, помогая определить концентрацию и наличие различных биомаркеров в тканях, которые являются характерными признаками онкологических процессов.
МФМ может использовать автофлуоресценцию флуорофоров собственных тканей и генерацию гармоник от компонентов тканевой матрицы, таких как коллаген, тем самым обеспечивая функциональную и структурную визуализацию неокрашенной биологической ткани [13-18]. Тогда как, для обычной конфокальной флуоресцентной микроскопии флуорофоры возбуждаются поглощением отдельных фотонов видимого или ультрафиолетового спектра, возбуждение методом МФМ влечет за собой одновременное поглощение двух и более фотонов обычно в ближнем инфракрасном диапазоне.
Это более длинноволновое инфракрасное излучение подвергается меньшему воздействию рассеяния, чем видимый свет, и, таким образом, может способствовать получению изображений с высоким разрешением и с большей глубиной проникновения в биологических тканях.
Данный метод является неразрушающим методом исследования благодаря тому, что излучение используемого диапазона имеет достаточно низкую энергию, которой недостаточно для фотодеградации или денатурации биологического объекта. При наличии эндогенных флуорофоров нет необходимости использовать дополнительную окраску, появляется возможность зарегистрировать и проанализировать такие флуоресцентные характеристики излучения, как время жизни флуоресценции, амплитуду флуоресценции и интенсивность флуоресцентного сигнала. При использовании данного метода флуоресценция возникает строго в фокальной плоскости фокусирующей системы прибора, благодаря чему, меняя фокусное расстояние, мы можем регистрировать сигнал флуоресценции на разной глубине, производя 3D сканирование образца [ 15].
Флуоресцентная микроскопия считается классическим подходом к выявлению вирусной инфекции, который использовался в исследованиях различных вирусов, например SARS-CoV и MERS-CoV [19]. Методы флуоресценции позволяют визуализировать вирусы и их специфические компоненты (белки и геном), а также целевые структуры и события в клетках-хозяевах.
В перспективе, подход, основанный на двухфотонном поглощении света, способен помочь не только в выявлении вирусных единиц на поверхности различных сред, но и в оценке глубины проникновения вирионов SARS-CoV-2, на основе анализа сигнала флуоресценции соответствующих белковых компонент.
Методы визуализации, основанные на флуоресценции нашли широкое применение в исследованиях клеток и живых организмов, потому что они чрезвычайно чувствительны и способны предоставлять информацию о биохимических взаимодействиях на молекулярном уровне. Интенсивность флуоресценции зависит от квантовой эффективности флуоресценции и концентрации флуорофора. Изображения интенсивности флуоресценции показывают, где в образце находятся флуорофоры, т.е. показывают пространственное строение исследуемого образца. Спектр флуоресценции является характерным для флоурофора. Изображения содержат спектральную информацию, позволяя определить флуорофоры в отдельных пикселях изображения. Время жизни флуоресценции или, точнее, функция затухания флуоресценции зависит от типа флуорофора, а не от их концентрации. Также она зависит и от молекулярной среды флуорофора. Функция фруоресцентного затухания и, следовательно, флуоресцентные изображения содержат информацию о молекулярном окружении молекул флуорофора или флуоресцентномеченных биомолекул [5,16,17,18,20].
Данная работа будет посвящена использованию метода многофотонной микроскопии для исследования диффузии раствора бычьего сывороточного альбумина в кожу ex-vivo, на сертифицированном многофотонном микроскопе MPTflex10 немецкой фирмы JenLab, в ближней инфракрасной области спектра, на длине волны 760 нм. В работе будет изучен способ изображения времени жизни флуоресценции и других флуоресцентных параметров, использующий время-коррелированный счет одиночных фотонов - TCSPC FLIM (Time Correlated Single Photon Counting for Fluorence Lifetime Imaging), описывающий время жизни флуоресценции различных эндогенных флуорофоров. Также, нами будет использована генерация оптических гармоник, и будет проведен анализ автофлуоресценции слоев дермы.
МФМ может использовать автофлуоресценцию флуорофоров собственных тканей и генерацию гармоник от компонентов тканевой матрицы, таких как коллаген, тем самым обеспечивая функциональную и структурную визуализацию неокрашенной биологической ткани [13-18]. Тогда как, для обычной конфокальной флуоресцентной микроскопии флуорофоры возбуждаются поглощением отдельных фотонов видимого или ультрафиолетового спектра, возбуждение методом МФМ влечет за собой одновременное поглощение двух и более фотонов обычно в ближнем инфракрасном диапазоне.
Это более длинноволновое инфракрасное излучение подвергается меньшему воздействию рассеяния, чем видимый свет, и, таким образом, может способствовать получению изображений с высоким разрешением и с большей глубиной проникновения в биологических тканях.
Данный метод является неразрушающим методом исследования благодаря тому, что излучение используемого диапазона имеет достаточно низкую энергию, которой недостаточно для фотодеградации или денатурации биологического объекта. При наличии эндогенных флуорофоров нет необходимости использовать дополнительную окраску, появляется возможность зарегистрировать и проанализировать такие флуоресцентные характеристики излучения, как время жизни флуоресценции, амплитуду флуоресценции и интенсивность флуоресцентного сигнала. При использовании данного метода флуоресценция возникает строго в фокальной плоскости фокусирующей системы прибора, благодаря чему, меняя фокусное расстояние, мы можем регистрировать сигнал флуоресценции на разной глубине, производя 3D сканирование образца [ 15].
Флуоресцентная микроскопия считается классическим подходом к выявлению вирусной инфекции, который использовался в исследованиях различных вирусов, например SARS-CoV и MERS-CoV [19]. Методы флуоресценции позволяют визуализировать вирусы и их специфические компоненты (белки и геном), а также целевые структуры и события в клетках-хозяевах.
В перспективе, подход, основанный на двухфотонном поглощении света, способен помочь не только в выявлении вирусных единиц на поверхности различных сред, но и в оценке глубины проникновения вирионов SARS-CoV-2, на основе анализа сигнала флуоресценции соответствующих белковых компонент.
Методы визуализации, основанные на флуоресценции нашли широкое применение в исследованиях клеток и живых организмов, потому что они чрезвычайно чувствительны и способны предоставлять информацию о биохимических взаимодействиях на молекулярном уровне. Интенсивность флуоресценции зависит от квантовой эффективности флуоресценции и концентрации флуорофора. Изображения интенсивности флуоресценции показывают, где в образце находятся флуорофоры, т.е. показывают пространственное строение исследуемого образца. Спектр флуоресценции является характерным для флоурофора. Изображения содержат спектральную информацию, позволяя определить флуорофоры в отдельных пикселях изображения. Время жизни флуоресценции или, точнее, функция затухания флуоресценции зависит от типа флуорофора, а не от их концентрации. Также она зависит и от молекулярной среды флуорофора. Функция фруоресцентного затухания и, следовательно, флуоресцентные изображения содержат информацию о молекулярном окружении молекул флуорофора или флуоресцентномеченных биомолекул [5,16,17,18,20].
Данная работа будет посвящена использованию метода многофотонной микроскопии для исследования диффузии раствора бычьего сывороточного альбумина в кожу ex-vivo, на сертифицированном многофотонном микроскопе MPTflex10 немецкой фирмы JenLab, в ближней инфракрасной области спектра, на длине волны 760 нм. В работе будет изучен способ изображения времени жизни флуоресценции и других флуоресцентных параметров, использующий время-коррелированный счет одиночных фотонов - TCSPC FLIM (Time Correlated Single Photon Counting for Fluorence Lifetime Imaging), описывающий время жизни флуоресценции различных эндогенных флуорофоров. Также, нами будет использована генерация оптических гармоник, и будет проведен анализ автофлуоресценции слоев дермы.
В результате проделанной работы были получены изображения морфологических структур дермы, таких, как коллагеновые и эластические волокна. Слои дермы успешно дифференцированы по структуре коллагена, эластина. Также, определены такие оптические характеристики эластического волокна дермы, как среднее время жизни флуоресценции волокна. Результат составил тт = 1437 ± 212 пс. По гистограммам распределения флуоресцентных параметров определено, что вышеперечисленные параметры подчиняются одномодовому распределению, также подтверждено, что эластические волокна представляют собой совокупность флуоресцирующих компонент, минимальное количество которых равняется двум.
Были получены и проанализированы изображения сигнала автофлуоресценции растворов бычьего сывороточного альбумина разных концентраций 35 г/м, 45г/м и 55 г/м. Из полученных данных определили, что в целом распределение времени жизни не изменяется при различной концентрации. Вычисленное время жизни флуоресценции альбумина лежит в следующих пределах 1100 ± 100 пс.
Далее производилась оценка интенсивности сигнала флуоресценции альбумина при увеличении глубины зондирования. Отношение интенсивности альбумина к интенсивности всего изображения падает с увеличением глубины проникновения. Это обусловлено появлением других флуорофоров с увеличением глубины зондирования. Результат для всех растворов оказался одинаковым. Определено, что диффузия не наблюдается после 10 минут экспозиции раствора на дерме.
Были получены и проанализированы изображения сигнала автофлуоресценции растворов бычьего сывороточного альбумина разных концентраций 35 г/м, 45г/м и 55 г/м. Из полученных данных определили, что в целом распределение времени жизни не изменяется при различной концентрации. Вычисленное время жизни флуоресценции альбумина лежит в следующих пределах 1100 ± 100 пс.
Далее производилась оценка интенсивности сигнала флуоресценции альбумина при увеличении глубины зондирования. Отношение интенсивности альбумина к интенсивности всего изображения падает с увеличением глубины проникновения. Это обусловлено появлением других флуорофоров с увеличением глубины зондирования. Результат для всех растворов оказался одинаковым. Определено, что диффузия не наблюдается после 10 минут экспозиции раствора на дерме.