ВВЕДЕНИЕ 4
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ПО ПРИМЕНЕНИЮ АМНИОТИЧЕСКОЙ ОБОЛОЧКИ И МЕТОДАМ ЕЁ ОБРАБОТКИ 7
1.1 Строение нативной амниотической оболочки 7
1.2 Области применения изолированной амниотической оболочки 8
1.3 Обоснование необходимости децеллюляризации трансплантатов 12
1.4 Перспективные подходы к децеллюляризации амниона 13
1.4.1 Децеллюляризация на основе детергента 13
1.4.2 Децеллюляризация на основе фермента 15
1.4.3 Механическая децеллюляризация 16
1.5 Критерии эффективности децеллюляризации амниона 17
1.5.1 Основные критерии эффективности 18
1.5.2 Дополнительные критерии эффективности 18
1.6 Сложности и ограничения в децеллюляризации амниона 19
2. ОПИСАНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БАЗЫ И МЕТОДОВ АНАЛИЗА 20
2.1 Материалы 20
2.1.1 Реактивы 20
2.1.2 Лабораторное оборудование 20
2.2 Методы 21
2.2.1 Забор тканей 21
2.2.2 Пробоподготовка образцов 22
2.2.3 Подбор параметров децеллюляризации амниотической оболочки ... 23
2.2.4 Гистологическое окрашивание 28
2.2.5 Механическое испытание на растяжение 29
2.2.6 Сканирующая электронная микроскопия 30
2.2.7 Атомно-силовая микроскопия 31
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ПРОВЕДЕННЫХ ЭКСПЕРИМЕНТОВ, ИХ
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ И ЗНАЧИМОСТЬ 33
3.1 Результаты 33
3.1.1 Оценка качества децеллюляризации 33
3.1.2 Структурные особенности амниотической оболочки после
децеллюляризации 44
3.1.3 Сравнение механических свойств нативной и
децеллюляризированной амниотической оболочки 55
3.2 Обсуждения результатов 61
ВЫВОДЫ 65
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 67
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 68
Актуальность темы исследования
В последние годы в литературе появляются данные о применении в реконструктивных целях аллогенной амниотической оболочки.
Привлекательность данного материала обусловлена высокой биосовместимостью, антибактериальной активностью, иммуномодулирующим действием и противоопухолевой активностью [1]. Более того в амниотической оболочке присутствуют факторы роста такие, как фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), фактор роста фибробластов (FGF), трансформирующий фактор роста бета (TGF-0), эпидермальный фактор роста (EGF) все они способствуют заживлению без образования рубцов [2].
Предварительная обработка донорской амниотической оболочки путем децеллюляризации может позволить избежать многих негативных последствий трансплантации, таких как воспаление и отторжение трансплантата, за счет удаления из нее потенциально иммуногенных клеток.
Объект исследования - децеллюляризация аллогенной амниотической оболочки.
Предмет исследования - способы регулирования эффективности децеллюляризации амниотической оболочки.
Цель - разработка протокола децеллюляризации амниотической оболочки.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
1. Анализ литературных данных по теме исследования.
2. Разработка протоколов децеллюляризации амниотической оболочки.
3. Оценка влияния режимов децеллюляризации на структурные свойства амниотической оболочки.
4. Сравнение механических параметров нативной и децеллюляризированой амниотической оболочек.
Представленная работа посвящена исследованию влияния различных протоколов децеллюляризации на амниотическую оболочку. Проведен и представлен теоретический и экспериментальный анализ материалов по разработке способа получения бесклеточной амниотической оболочки.
Методы данного исследования - анализ литературы относительно способов обработки амниотической оболочки; экспериментальное исследование; статистическая обработка данных.
База исследования - эксперимент проводили на базе Института регенеративной медицины Научно-технологического парка биомедицины ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет), донорский материал (плацента) был получен из Клиники акушерства и гинекологии имени В. Ф. Снегирева.
Структура работы: введение, три главы, заключение, список использованной литературы и приложения.
Во введении работы обоснована актуальность выбранной темы исследования, определена цель и задачи исследования.
В первой главе работы «Обзор литературы по применению амниотической оболочки и методам её обработки» представлена актуальность поиска новых материалов для реконструктивных целей, преимущества применения амниотической оболочки для реконструктивных целей, описание подходов и нерешенных вопросов в области децеллюляризации амниотической оболочки.
Во второй главе работы «Описание экспериментальной базы и методов анализа» представлено описание методов для характеризации бесклеточной и нативной амниотической оболочки; проведены эксперименты с децеллюляризованной и нативной амниотической оболочкой.
В третьей главе «Результаты проведённых экспериментов, их интерпретация и значимость» представлена информация о результатах проведенных экспериментов и сопоставление их с литературными данными по тематике исследования.
В заключении работы сделаны основополагающие выводы по результатам исследования.
В ходе исследования проведена сравнительная оценка различных протоколов децеллюляризации амниотической оболочки, направленных на полное удаление клеточных элементов при максимальном сохранении ВКМ. Наибольшую эффективность продемонстрировали два метода: обработка детергентной смесью SDS/Triton X-100 (0,03%/1% в течение 26 часов) и ферментативная обработка трипсин/ЭДТА (0,2%/0,1% в течение 30 минут при 38°С). Сравнительный анализ показал, что оба метода обеспечивают полную децеллюляризацию, однако детергентная обработка в меньшей степени влияет на плотность соединительной ткани, сохраняя ее нативную архитектонику, тогда как ферментативный метод требует значительно меньшего времени обработки.
Механические испытания выявили значимые изменения биомеханических свойств обработанных образцов. Наибольшее увеличение жесткости и прочности наблюдалось при использовании SDS/ЭДТА и NaOH/Na2SO4, что связано с их агрессивным воздействием на неклеточные компоненты матрикса. В то же время SDS/Triton X100 обеспечивал сохранение механических характеристик, близких к нативному образцу. Ферментативная обработка трипсин/ЭДТА приводила к снижению как жесткости, так и максимальной нагрузки, что ограничивает его применение в случаях, требующих сохранения механической стабильности тканевого каркаса.
Исследования методом атомно-силовой микроскопии выявили структурно-механическую гетерогенность амниотической оболочки с достоверными различиями упругих свойств между эпителиальной и базальной поверхностями. Детергентные смеси вызывали наибольшее изменение упругих свойств, свидетельствующее о модификации структурной организации ВКМ, тогда как протеолитические ферменты преимущественно снижали механическую жесткость оболочки.
Анализ сканирующей электронной микроскопии показал, что все изученные методы обработки вызывают существенную модификацию ультраструктуры ткани, проявляющуюся в изменении плотности упаковки фибриллярных компонентов и увеличении пористости матрикса. При этом сохраняется базовый архитектонический каркас ВКМ, что указывает на избирательный характер воздействия применяемых агентов. Ферментативные обработки приводят к более равномерной деградации матрикса, тогда как детергентные характеризуются формированием грубопористых структур.
