Создание биомиметичных скаффолдов из гиалуроновой кислоты и желатина методом электроспиннинга для тканевой инженерии
|
ВВЕДЕНИЕ 5
1 ОСНОВНЫЕ ТЕНДЕНЦИИ В СКАФФОЛДИНГЕ ДЛЯ ТКАНЕВОЙ ИНЖЕНЕРИИ 9
1.1 Тканевая инженерия 9
1.2 Скаффолды 10
1.2.1 Требования к скаффолдам 11
1.2.2 Материалы для скаффолдов 14
1.2.3 Методы создания скаффолдов 15
1.3 Электроспиннинг 17
1.3.1 Параметры, влияющие на эффективность электроспиннинга .. 18
1.4 Материалы для создания скаффолдов 19
1.4.1 Гиалуроновая кислота 20
1.4.2 Желатин 23
1.5 Химическое сшивание 27
1.5.1 Химическое сшивание гиалуроновой кислоты при помощи
EDC/NHS 28
1.5.2 Химическое сшивание желатина при помощи EDC/NHS 30
1.5.2 Промывание скаффолдов после сшивки 33
1.6 Основные результаты 34
2 МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ ЭЛЕКТРОСПИННИНГОВЫХ СКАФФОЛДОВ
НА ОСНОВЕ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ И ЖЕЛАТИНА 37
2.1 Получение растворов для электроспиннинга 37
2.2 Процесс электроспиннинга 38
2.3 Сшивка скаффолдов 39
2.4 Измерение вязкости раствора 40
2.5 Измерение контактного угла смачивания 40
2.6 Растровая электронная микроскопия 41
2.7 Механические испытания 41
2.8 Анализ реакций сшивания скаффолдов при помощи ИК-
спекторметрии 41
2.9 Исследование цитотоксичности скаффолдов при помощи клеточных
структур 41
3 АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 43
3.1 Исследование влияния концентрации и массового соотношения
гиалуроновой кислоты и желатина на реологические характеристики раствора 43
3.2 Анализ влияния физико-химических взаимодействий компонентов
раствора на морфологию, диаметр и степень однородности получаемых волокон 46
3.3 Определение закономерности влияния концентрации желатина в
составе раствора на механические свойства скаффолдов 52
3.4 Оценка влияния различных условий химического сшивания на
структуру и стабильность поперечно-сшитых сетей 55
3.4.1 ИК-спектрометрия скаффолдов после химического сшивания 60
3.5 Физико-химический анализ изменения гидрофильных свойств
поверхности и структуры скаффолдов в зависимости от состава полимерной матрицы и условий постобработки 63
3.6 Оценка биологической совместимость разработанных скаффолдов
путём изучения их влияния на жизнеспособность, адгезию и пролиферацию клеточных культур 66
ВЫВОДЫ 70
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 72
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ 73
1 ОСНОВНЫЕ ТЕНДЕНЦИИ В СКАФФОЛДИНГЕ ДЛЯ ТКАНЕВОЙ ИНЖЕНЕРИИ 9
1.1 Тканевая инженерия 9
1.2 Скаффолды 10
1.2.1 Требования к скаффолдам 11
1.2.2 Материалы для скаффолдов 14
1.2.3 Методы создания скаффолдов 15
1.3 Электроспиннинг 17
1.3.1 Параметры, влияющие на эффективность электроспиннинга .. 18
1.4 Материалы для создания скаффолдов 19
1.4.1 Гиалуроновая кислота 20
1.4.2 Желатин 23
1.5 Химическое сшивание 27
1.5.1 Химическое сшивание гиалуроновой кислоты при помощи
EDC/NHS 28
1.5.2 Химическое сшивание желатина при помощи EDC/NHS 30
1.5.2 Промывание скаффолдов после сшивки 33
1.6 Основные результаты 34
2 МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ ЭЛЕКТРОСПИННИНГОВЫХ СКАФФОЛДОВ
НА ОСНОВЕ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ И ЖЕЛАТИНА 37
2.1 Получение растворов для электроспиннинга 37
2.2 Процесс электроспиннинга 38
2.3 Сшивка скаффолдов 39
2.4 Измерение вязкости раствора 40
2.5 Измерение контактного угла смачивания 40
2.6 Растровая электронная микроскопия 41
2.7 Механические испытания 41
2.8 Анализ реакций сшивания скаффолдов при помощи ИК-
спекторметрии 41
2.9 Исследование цитотоксичности скаффолдов при помощи клеточных
структур 41
3 АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 43
3.1 Исследование влияния концентрации и массового соотношения
гиалуроновой кислоты и желатина на реологические характеристики раствора 43
3.2 Анализ влияния физико-химических взаимодействий компонентов
раствора на морфологию, диаметр и степень однородности получаемых волокон 46
3.3 Определение закономерности влияния концентрации желатина в
составе раствора на механические свойства скаффолдов 52
3.4 Оценка влияния различных условий химического сшивания на
структуру и стабильность поперечно-сшитых сетей 55
3.4.1 ИК-спектрометрия скаффолдов после химического сшивания 60
3.5 Физико-химический анализ изменения гидрофильных свойств
поверхности и структуры скаффолдов в зависимости от состава полимерной матрицы и условий постобработки 63
3.6 Оценка биологической совместимость разработанных скаффолдов
путём изучения их влияния на жизнеспособность, адгезию и пролиферацию клеточных культур 66
ВЫВОДЫ 70
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 72
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ 73
Создание скаффолдов для тканевой инженерии представляет собой одну из ключевых задач современной регенеративной медицины [1]. Скаффолд или синтетический внеклеточный матрикс (ВКМ) является временной структурой, которая служит опорой для растущих клеток и тканей. Так, предлагается использовать скаффолды в регенерации повреждений роговицы человека. Например, мезенхимальные стромальные клетки (C-MSC) способны ингибировать рубцевание роговицы, однако их доставка в форме глазных капель неэффективна из-за быстрого вымывания слезной жидкостью. В этом контексте нановолоконные скаффолды могут обеспечить удержание клеток в зоне повреждения, повышая их терапевтическую эффективность [2]. Среди множества биоматериалов, используемых для этих целей, особое внимание уделяется гиалуроновой кислоте (ГК) [3]. Благодаря тому, что ГК является гликозаминогликаном, входящем в состав ВКМ роговицы, она ускоряет заживление стромальных повреждений и эпителизацию за счет взаимодействия с С044-рецепторами на мембранах клеток. [4 - 6]. Однако процесс электроформирования растворов ГК затруднителен [7, 8].
Дополнительно, высокая влагоудерживающая способность ГА приводит к склеиванию волокон на коллекторе из-за недостаточного испарения растворителей [9]. Для решения этих проблем предложено использование композитов ГА с желатином. Он, как производное коллагена, демонстрирует свойства, необходимые для воспроизведения внеклеточного матрикса, легче поддается электроспиннингу и не вызывает иммунный ответ [10, 11]. В офтальмологии он способствует регенерации стромы роговицы и ускоряет повторную эпителизацию, что делает его ценным материалом для заживления повреждений [12, 13]. Из-за высокой гидрофильности как ГК, так и желатин, применяются методы сшивки. Соединение сшивающих агентов 1-Этил-3-(3- диметиламинопропил) карбодиимида (EDC) с N-гидроксисукцинимидом (NHS) минимизирует токсичность и способствует повышению механических и гидрофобных свойств материала [14 - 16]. Таким образом проведение этого 5
исследования открывает перспективы разработки материалов, способных эффективно поддерживать процессы заживления повреждений роговицы, и могут быть использованы в тканевой инженерии [17, 18].
Цель работы - установить закономерности формирования структуры, реологических и физико-химических свойств нановолокнистых биомиметических скаффолдов на основе гиалуроновой кислоты и желатина, полученных методом электроспиннинга, и выявить влияние условий химического сшивания на их биомеханические характеристики и биосовместимость.
Задачи исследования:
1. Исследовать влияние концентрации и массового соотношения гиалуроновой кислоты и желатина на реологические характеристики исходных растворов и определить условия, способствующие формированию стабильных и однородных волокон методом электроспиннинга.
2. Установить закономерности влияния параметров электроспиннинга (напряжения, скорости подачи раствора, расстояния до коллектора) и физико-химических взаимодействий компонентов раствора на морфологию, диаметр и степень однородности получаемых волокон.
3. Определить закономерности влияния концентрации желатина в составе раствора на механические свойства (прочность, модуль упругости, относительное удлинение получаемых скаффолдов).
4. Выявить влияние различных условий химического сшивания (состав, концентрация и продолжительность реакции сшивающих агентов EDC/NHS, тип и состав растворителя) на структуру и стабильность поперечно-сшитых сетей, используя методы ИК-Фурье спектроскопии, реологии и анализа механических свойств.
5. Провести детальный физико-химический анализ изменения гидрофильных свойств поверхности и структуры скаффолдов в зависимости от состава полимерной матрицы и условий постобработки, применяя методы контактного угла смачивания и электронной микроскопии.
6. Оценить биологическую совместимость разработанных скаффолдов путём изучения их влияния на жизнеспособность, адгезию и пролиферацию модельных клеточных культур in vitro, выявив оптимальный состав и условия химической стабилизации для применения в тканевой инженерии.
Научная новизна работы состоит в следующем:
1. Впервые установлены закономерности влияния массового соотношения гиалуроновой кислоты и желатина на реологические свойства исходных растворов, получаемых для электроспиннинга, и на основании комплекса реометрических и спектроскопических исследований выявлены условия, обеспечивающие стабильность и однородность формируемых нановолокон.
2. Проведён комплексный физико-химический анализ влияния условий химического сшивания (состав растворителя, концентрация и время реакции EDC/NHS) на структуру, гидрофильные и механические свойства скаффолдов на основе гиалуроновой кислоты и желатина. Установлены оптимальные условия сшивки, обеспечивающие баланс между стабильностью структуры и сохранением биоактивных свойств исходных полимеров.
3. Получены новые данные относительно кинетики взаимодействия и структурной организации полимерных цепей гиалуроновой кислоты и желатина в процессе химического сшивания, подтверждённые методами ИК- Фурье спектроскопии и электронной микроскопии. Показано, что гидрофильность и биосовместимость скаффолдов коррелируют с изменением амидных связей и поверхностной структурой материала после постобработки.
Практическая значимость работы заключается в том, что разработанные биомиметические скаффолды на основе гиалуроновой кислоты и желатина, стабилизированные методом химического сшивания, обладают оптимальными физико-химическими и биологическими характеристиками, обеспечивающими эффективную клеточную адгезию и пролиферацию. Это позволяет рекомендовать предложенные материалы для применения в офтальмологии, в частности для создания новых материалов, способных поддерживать регенерацию повреждённой роговицы и эффективно удерживать терапевтические клетки и биологически активные вещества в зоне поражения.
Личный вклад автора в предоставляемую работу состоит в:
1. Анализе и критическом обзоре современных литературных данных, формулировании целей, задач и направлений исследования.
2. Приготовлении и оптимизации всех растворов для электроспиннинга, формировании скаффолдов методом электроспиннинга и проведении их химического сшивания.
3. Самостоятельном выполнении физико-химических исследований (реологических и механических) по оценке разработанных материалов.
4. Обработке экспериментальных данных, выполнении их комплексного анализа, обобщении и формулировании научно обоснованных выводов.
Работа была выполнена на базе Института регенеративной медицины Сеченовского университета.
Автор выражает искреннюю благодарность своему научному руководителю Ефремову Юрию Михайловичу за квалифицированное и внимательное руководство в течение всего периода выполнения работы; директору Института регенеративной медицины за конструктивную критику и ценные советы - Тимашеву Петру Сергеевичу, а также сотрудникам отдела современных биоматериалов за консультации при выполнении экспериментальных исследований, а именно Аксеновой Надежде Анатольевне. Особую благодарность автор выражает своему научному консультанту Тугаевой Гиляне Константиновне за наставничество, подробные рекомендации и помощь в организации научных исследований.
Дополнительно, высокая влагоудерживающая способность ГА приводит к склеиванию волокон на коллекторе из-за недостаточного испарения растворителей [9]. Для решения этих проблем предложено использование композитов ГА с желатином. Он, как производное коллагена, демонстрирует свойства, необходимые для воспроизведения внеклеточного матрикса, легче поддается электроспиннингу и не вызывает иммунный ответ [10, 11]. В офтальмологии он способствует регенерации стромы роговицы и ускоряет повторную эпителизацию, что делает его ценным материалом для заживления повреждений [12, 13]. Из-за высокой гидрофильности как ГК, так и желатин, применяются методы сшивки. Соединение сшивающих агентов 1-Этил-3-(3- диметиламинопропил) карбодиимида (EDC) с N-гидроксисукцинимидом (NHS) минимизирует токсичность и способствует повышению механических и гидрофобных свойств материала [14 - 16]. Таким образом проведение этого 5
исследования открывает перспективы разработки материалов, способных эффективно поддерживать процессы заживления повреждений роговицы, и могут быть использованы в тканевой инженерии [17, 18].
Цель работы - установить закономерности формирования структуры, реологических и физико-химических свойств нановолокнистых биомиметических скаффолдов на основе гиалуроновой кислоты и желатина, полученных методом электроспиннинга, и выявить влияние условий химического сшивания на их биомеханические характеристики и биосовместимость.
Задачи исследования:
1. Исследовать влияние концентрации и массового соотношения гиалуроновой кислоты и желатина на реологические характеристики исходных растворов и определить условия, способствующие формированию стабильных и однородных волокон методом электроспиннинга.
2. Установить закономерности влияния параметров электроспиннинга (напряжения, скорости подачи раствора, расстояния до коллектора) и физико-химических взаимодействий компонентов раствора на морфологию, диаметр и степень однородности получаемых волокон.
3. Определить закономерности влияния концентрации желатина в составе раствора на механические свойства (прочность, модуль упругости, относительное удлинение получаемых скаффолдов).
4. Выявить влияние различных условий химического сшивания (состав, концентрация и продолжительность реакции сшивающих агентов EDC/NHS, тип и состав растворителя) на структуру и стабильность поперечно-сшитых сетей, используя методы ИК-Фурье спектроскопии, реологии и анализа механических свойств.
5. Провести детальный физико-химический анализ изменения гидрофильных свойств поверхности и структуры скаффолдов в зависимости от состава полимерной матрицы и условий постобработки, применяя методы контактного угла смачивания и электронной микроскопии.
6. Оценить биологическую совместимость разработанных скаффолдов путём изучения их влияния на жизнеспособность, адгезию и пролиферацию модельных клеточных культур in vitro, выявив оптимальный состав и условия химической стабилизации для применения в тканевой инженерии.
Научная новизна работы состоит в следующем:
1. Впервые установлены закономерности влияния массового соотношения гиалуроновой кислоты и желатина на реологические свойства исходных растворов, получаемых для электроспиннинга, и на основании комплекса реометрических и спектроскопических исследований выявлены условия, обеспечивающие стабильность и однородность формируемых нановолокон.
2. Проведён комплексный физико-химический анализ влияния условий химического сшивания (состав растворителя, концентрация и время реакции EDC/NHS) на структуру, гидрофильные и механические свойства скаффолдов на основе гиалуроновой кислоты и желатина. Установлены оптимальные условия сшивки, обеспечивающие баланс между стабильностью структуры и сохранением биоактивных свойств исходных полимеров.
3. Получены новые данные относительно кинетики взаимодействия и структурной организации полимерных цепей гиалуроновой кислоты и желатина в процессе химического сшивания, подтверждённые методами ИК- Фурье спектроскопии и электронной микроскопии. Показано, что гидрофильность и биосовместимость скаффолдов коррелируют с изменением амидных связей и поверхностной структурой материала после постобработки.
Практическая значимость работы заключается в том, что разработанные биомиметические скаффолды на основе гиалуроновой кислоты и желатина, стабилизированные методом химического сшивания, обладают оптимальными физико-химическими и биологическими характеристиками, обеспечивающими эффективную клеточную адгезию и пролиферацию. Это позволяет рекомендовать предложенные материалы для применения в офтальмологии, в частности для создания новых материалов, способных поддерживать регенерацию повреждённой роговицы и эффективно удерживать терапевтические клетки и биологически активные вещества в зоне поражения.
Личный вклад автора в предоставляемую работу состоит в:
1. Анализе и критическом обзоре современных литературных данных, формулировании целей, задач и направлений исследования.
2. Приготовлении и оптимизации всех растворов для электроспиннинга, формировании скаффолдов методом электроспиннинга и проведении их химического сшивания.
3. Самостоятельном выполнении физико-химических исследований (реологических и механических) по оценке разработанных материалов.
4. Обработке экспериментальных данных, выполнении их комплексного анализа, обобщении и формулировании научно обоснованных выводов.
Работа была выполнена на базе Института регенеративной медицины Сеченовского университета.
Автор выражает искреннюю благодарность своему научному руководителю Ефремову Юрию Михайловичу за квалифицированное и внимательное руководство в течение всего периода выполнения работы; директору Института регенеративной медицины за конструктивную критику и ценные советы - Тимашеву Петру Сергеевичу, а также сотрудникам отдела современных биоматериалов за консультации при выполнении экспериментальных исследований, а именно Аксеновой Надежде Анатольевне. Особую благодарность автор выражает своему научному консультанту Тугаевой Гиляне Константиновне за наставничество, подробные рекомендации и помощь в организации научных исследований.
1. Комплексом физико-химических методов исследованы растворы на основе гиалуроновой кислоты (ГК) и желатина, предназначенные для формирования электроспиннинговых нановолокон. Установлено, что важнейшими факторами, определяющими реологическое поведение растворов и успешность процесса электроспиннинга, являются концентрация и массовое соотношение компонентов. Определены оптимальные условия приготовления растворов, обеспечивающие стабильность и однородность волокон, полученных методом электроспиннинга.
2. На основании результатов растровой электронной микроскопии подробно изучены закономерности изменения морфологии скаффолдов в зависимости от состава полимерной матрицы. Выявлено, что при массовом соотношении ГК/желатин 1/2 достигается максимальная однородность волоконной структуры, оптимальный диаметр волокон (1,52±0,68 мкм) и толщина формируемого материала (0,35±0,03 мм), что подтверждается корреляцией с реологическими данными исходных растворов.
3. По данным анализа механических свойств полученных скаффолдов было выявлено, что при увеличении концентрации желатина Модуль Юнга увеличивается линейно. При этом, анализ значений прочности на разрыв (7,25 ± 1,10 МПа) и относительного удлинения при разрыве (10,44 ± 3,86, %) выявил, что соотношении ГК/Желатин 1/2 показало наибольший результат по сравнению с остальными образцами, что обусловлено образованием полиэлектролитного комплекса, приводящего к формированию плотной волокнистой структуры.
4. Проведен детальный физико-химический анализ влияния условий химического сшивания (растворитель, концентрация и время обработки EDC/NHS) на структурные характеристики и гидрофильные свойства скаффолдов методом ИК-Фурье спектроскопии и контактного угла смачивания. Установлено, что наибольшая степень сшивания и наилучшая структурная стабильность достигается при использовании системы EDC/NHS (соотношение 2,5:1) в среде ацетонитрила при времени реакции 24 часа, с последующей этанольной промывкой. Показано, что именно эти условия обеспечивают минимальное набухание волокон и сохранение высоких биофункциональных свойств.
5. Впервые экспериментально выявлена взаимосвязь состава
полимерных композитов и их механических характеристик (прочность на разрыв, модуль Юнга и относительное удлинение). Показано, что оптимальными механическими параметрами (прочность на разрыв - 7,25±1,10 МПа, модуль Юнга - 68,59±19,86 МПа и относительное удлинение при разрыве - 10,44±3,86%) характеризуются скаффолды с массовым
соотношением ГК/желатин 1:2, что обусловлено балансом межмолекулярных взаимодействий в полиэлектролитной системе.
6. Изучены биологические характеристики разработанных скаффолдов, включая жизнеспособность и адгезию модельных клеточных культур. Показано, что композиции с массовым соотношением ГК/желатин 1:1 и 1:2 обладают наибольшей биосовместимостью (жизнеспособность клеток составляет 79,2% и 86,4% соответственно), что согласуется с оптимальными физико-химическими и структурно-механическими параметрами данных материалов.
7. Полученные результаты подтверждают перспективность разработанных биомиметических скаффолдов на основе гиалуроновой кислоты и желатина для тканевой инженерии и регенеративной медицины, в частности для офтальмологических применений, связанных с восстановлением повреждений роговицы. Предложенные материалы рекомендованы к дальнейшим экспериментальным исследованиям in vivo и оптимизации их взаимодействия с мезенхимальными стромальными клетками для эффективного лечения и восстановления поврежденных тканей.
2. На основании результатов растровой электронной микроскопии подробно изучены закономерности изменения морфологии скаффолдов в зависимости от состава полимерной матрицы. Выявлено, что при массовом соотношении ГК/желатин 1/2 достигается максимальная однородность волоконной структуры, оптимальный диаметр волокон (1,52±0,68 мкм) и толщина формируемого материала (0,35±0,03 мм), что подтверждается корреляцией с реологическими данными исходных растворов.
3. По данным анализа механических свойств полученных скаффолдов было выявлено, что при увеличении концентрации желатина Модуль Юнга увеличивается линейно. При этом, анализ значений прочности на разрыв (7,25 ± 1,10 МПа) и относительного удлинения при разрыве (10,44 ± 3,86, %) выявил, что соотношении ГК/Желатин 1/2 показало наибольший результат по сравнению с остальными образцами, что обусловлено образованием полиэлектролитного комплекса, приводящего к формированию плотной волокнистой структуры.
4. Проведен детальный физико-химический анализ влияния условий химического сшивания (растворитель, концентрация и время обработки EDC/NHS) на структурные характеристики и гидрофильные свойства скаффолдов методом ИК-Фурье спектроскопии и контактного угла смачивания. Установлено, что наибольшая степень сшивания и наилучшая структурная стабильность достигается при использовании системы EDC/NHS (соотношение 2,5:1) в среде ацетонитрила при времени реакции 24 часа, с последующей этанольной промывкой. Показано, что именно эти условия обеспечивают минимальное набухание волокон и сохранение высоких биофункциональных свойств.
5. Впервые экспериментально выявлена взаимосвязь состава
полимерных композитов и их механических характеристик (прочность на разрыв, модуль Юнга и относительное удлинение). Показано, что оптимальными механическими параметрами (прочность на разрыв - 7,25±1,10 МПа, модуль Юнга - 68,59±19,86 МПа и относительное удлинение при разрыве - 10,44±3,86%) характеризуются скаффолды с массовым
соотношением ГК/желатин 1:2, что обусловлено балансом межмолекулярных взаимодействий в полиэлектролитной системе.
6. Изучены биологические характеристики разработанных скаффолдов, включая жизнеспособность и адгезию модельных клеточных культур. Показано, что композиции с массовым соотношением ГК/желатин 1:1 и 1:2 обладают наибольшей биосовместимостью (жизнеспособность клеток составляет 79,2% и 86,4% соответственно), что согласуется с оптимальными физико-химическими и структурно-механическими параметрами данных материалов.
7. Полученные результаты подтверждают перспективность разработанных биомиметических скаффолдов на основе гиалуроновой кислоты и желатина для тканевой инженерии и регенеративной медицины, в частности для офтальмологических применений, связанных с восстановлением повреждений роговицы. Предложенные материалы рекомендованы к дальнейшим экспериментальным исследованиям in vivo и оптимизации их взаимодействия с мезенхимальными стромальными клетками для эффективного лечения и восстановления поврежденных тканей.
