Аннотация
ВВЕДЕНИЕ 5
1 Обзор литературы 7
1.1 Общие представления о плазме 7
1.2 Эффекты низкотемпературной плазмы 8
1.3 Свободные радикалы 14
1.3.1 Гидроксильный радикал 16
1.3.2 Супероксидный радикал 18
1.3.3 Перекись водорода 19
1.4. Генерация АФК в клетке и антиоксидантная система 20
1.5 Противоопухолевые эффекты НТП 23
2 Материалы и методы 36
2.1 Характеристика объектов и условий экспериментов 36
2.1.1 Клеточные линии 36
2.1.2 Среды и реактивы 36
2.1.3 Экспериментальная установка 36
2.2 Методы 38
2.2.1 Подсчет клеток 38
2.2.2 Методика воздействия на культуры клеток 38
2.2.3 Методика оценки жизнеспособности клеток 38
2.2.4 Методика определения апоптической и некротической клеточной
гибели 39
2.2.5 Методика определения активных форм кислорода 40
2.2.6 Метод флуоресцентной микроскопии 41
2.2.7 Методика проточной цитометрии 41
2.2.8 Статистическая обработка полученных данных 42
3 Результаты 43
3.1 Цитотоксичность ПАМ на культурах клеток 43
3.1.1 Оценка жизнеспособности клеток HeLa 43
3.1.2 Оценка жизнеспособности клеток MCF-7 44
3.1.3 Оценка жизнеспособности клеток CHO-k1 45
3.2 Апоптоз-индуцирующая способность ПАМ 47
3.2.1 Оценка типа клеточной гибели линии HeLa 47
3.2.2 Оценка типа клеточной гибели линии MCF-7 49
3.2.3 Оценка типа клеточной гибели линии CHO-k1 51
3.3 Уровень АФК в клетках после обработки ПАМ 52
3.3.1 Анализ наличия АФК в клеточной линии HeLa 53
3.3.2 Анализ наличия АФК в клеточной линии MCF-7 55
3.3.3 Анализ наличия АФК в клеточной линии CHO-k1 57
4 Обсуждение результатов 59
ВЫВОДЫ 62
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 63
Применение низкотемпературной плазмы (НТП) атмосферного давления в медицине и биологии в последние годы вызывает большой интерес. Это обусловлено тем, что холодная плазма и плазмо-активированные жидкости позволяют эффективно стерилизовать различные поверхности и живые ткани, стимулировать заживление тканей и пролиферацию клеток [1].
Плазмо-активированные среды (ПАМ) представляют собой облученные сгенерированными свободными радикалами культуральные среды, в которые помещаются участвующие в эксперименте клетки. Такие клетки подвергаются воздействию свободных радикалов не напрямую, а через среду.
Особый интерес представляют возможности применения холодной плазмы в онкологии, вследствие ее дифференциального воздействия на здоровые и опухолевые клетки [2]. Большинство исследователей связывают механизм цитотоксических эффектов плазменного облучения с генерацией активных форм кислорода (АФК) и активных форм азота (АФА) [3]. Поэтому важно проводить эксперименты, которые смогут показать, как именно различные линии опухолевых и нормальных клеток реагируют в ответ на плазменное воздействие [4].
Исследования данной темы важны, поскольку много аспектов еще не раскрыты до конца. Например, каскад реакций, который возникает в клетке после действия плазмы или конкретные факторы, способствующие гибели клеток. До сих пор не известно являются ли именно активные формы кислорода медиаторами низкотемпературной плазмы [6].
С другой стороны, объяснено множество путей реализации НТП в клетках так, что появилась возможность подстройки конкретных параметров плазмы по отношению к параметрам клетки. Это означает, что для каждого клинического случая может быть подобран индивидуальный режим работы устройства, генерирующего плазму [2].
Целью настоящего исследования является анализ характера и механизмов действия плазмо-активированных сред на опухолевые и нормальные клетки.
Задачи исследования:
1. Исследовать воздействие плазмо-активированных сред на различные линии опухолевых клеток - HeLa, MCF-7, а также на нормальные клетки - CHO-k1
2. Оценить жизнеспособность обработанных клеток с помощью МТТ-теста
3. Оценить наличие внутриклеточных активных форм кислорода после обработки плазмо-активированными средами
4. Определить типы клеточной гибели после воздействия плазмоактивированных сред посредством определения уровня апоптоза и некроза в обработанных клеточных линиях
1. Непрямая обработка клеток низкотемпературной плазмой при частоте генератора 2 кГц и времени экспозиции 60 с способна сильно ингибировать пролиферативную активность опухолевых клеток.
2. Оценка цитотоксичности действия ПАМ на нормальные клетки показала слабо выраженный ингибирующий пролиферацию эффект.
3. При оценке типа клеточной гибели было обнаружено, что ПАМ вызывает в основном апоптотическую гибель в нормальных клетках.
4. Вероятный механизм гибели опухолевых клеток - окислительный стресс, вызванный активными формами кислорода.
5. Нормальные клетки имеют большую резистентность к деструктивному действию АФК.
