ВВЕДЕНИЕ 4
Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 6
1.1. Клубеньковые бактерии 6
1.2. Регуляция численности бактерий в ризосфере и почве 18
1.3. Антибактериальные соединения микроорганизмов 23
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 31
2.1. Объекты исследования 31
2.2. Методы исследования 33
2.2.1. Приготовление питательных сред для культивирования
клубеньковых бактерий 33
2.2.2. Оживление штаммов клубеньковых бактерий после криохранения 33
2.2.3. Получение бактериального газона 34
2.2.4. Определение механизма антибактериальной активности 34
2.2.5. Скрининг штаммов на синтез антибактериальных соединений на
газоне ризобий 35
2.2.6. Скрининг штаммов на синтез антибактериальных соединений на
газоне клеток E. co/zATolC, трансформированных векторной конструкцией pDualrep2 36
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 37
3.1. Подбор штаммов и условий культивирования для бактериального газона 37
3.2. Скрининг коллекционных штаммов клубеньковых бактерий на синтез соединений, подавляющих рост типовых и родственных штаммов ризобий. 39
3.3. Скрининг штаммов, обладающих антибактериальной активностью, на способность подавлять рост штамма E. co/zATolC, трансформированного векторной конструкцией pDualrep2 43
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 47
ВЫВОДЫ 49
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ И ЛИТЕРАТУРЫ 50
Одним из ключевых процессов, от которых зависит биологическая продуктивность на Земле, является фиксация атмосферного азота микроорганизмами. Выделяют две группы микроорганизмов, которые фиксируют атмосферный азот. Одна из них существует в симбиозе с высшими растениями и образует клубеньки на корнях. К ним относятся клубеньковые бактерии.
Клубеньковые бактерии специфичны, поэтому некоторые бактерии встречаются только в корнях клевера, но не могут поражать корни гороха, люцерны, люпина и других бобовых культур. Группы бактерий, образующие клубеньки на корнях люпинов и серраделей, не заражают корни клевера, гороха и другие. Клубеньковые бактерии представляют собой группу почвенных микроорганизмов, которые преобразовывают инертный азот в усвояемую форму (аммиак) в специализированных структурах - клубеньках, формируемых на корнях бобового растения - хозяина. Таким бактериям-микросимбионтам для успешной колонизации и инфицирования корней растения-хозяина необходимо противостоять в конкурентной борьбе другим близкородственным ризобиям и посторонней микрофлоре ризосферы. Для этого они выделяют различные вещества, которые подавляют рост других микроорганизмов. Известно, что некоторые ризобии синтезируют бактериоцины - это соединения различной природы, специфично подавляющих рост гомологичных ризобий. Бактериоцины обладают узким спектром активности и имеют белковую природу, что и отличает их от антибиотиков. Бактериоцины можно определить как белковые токсины, синтезируемые на рибосомах, продуцируемые грамположительными и грамотрицательными бактериями, которые ингибируют рост близкородственных видов и штаммов бактерий. Они являются одним из видов оружия против микроорганизмов из -за своих разнообразных структур, функций, природных ресурсов и специфических свойств, таких как термостойкость. В последние годы были получены бактериоцины и протестированы на пригодность к использованию в пищевых технологиях для продления срока хранения продуктов, лечения рака, также улучшения здоровья человека. Поэтому бактериоцины имеют потенциал замены антибиотиков в лечении патогенов с множественной лекарственной устойчивостью в будущем. Среди бактериоцинов к настоящему времени хорошо описаны два пептида: трифолицин и фазолицин, которые работают как узкоспецифичные антибиотики. Фазолицин относится к рибосомно синтезированным и посттрансляционно-модифицированным пептидам (RiPP). Фазолицин обладает антибактериальной активностью и может ингибировать рост различных бактерий из родов Rhizobium и Sinorhizobium. На данный момент ризобии являются уникальным объектом для исследования регуляции численности бактерий и источником для поиска новых антибактериальных соединений, потенциально применимых для разработки на их основе антибиотиков для нужд сельского хозяйства и медицины.
Цель
Поиск и оценка распространенности среди клубеньковых бактерий Rhizobium leguminosarum штаммов, синтезирующих вещества, подавляющие рост близкородственных бактерий.
Задачи
1) Отработать методику культивирования ризобий для определения оптимальных условий синтеза антибактериальных соединений.
2) Провести скрининг штаммов из коллекции «Симбионт» на синтез соединений, подавляющих рост типовых и родственных штаммов ризобий.
3) Провести скрининг штаммов, обладающих антибактериальной активностью, на способность подавлять рост штамма E. coli, трансформированного векторной конструкцией pDualrep2. При наличии подавления роста определить механизм его действия.
Ризобии являются бактериями, которые вступают в азотфиксирующий симбиоз с бобовыми растениями. Им для хорошей колонизации и инфицирования корней растения-хозяина нужно противостоять в конкуренции близкородственным или другим типовым бактериям, соответственно ризобии выделяют различные вещества, такие как бактериоцины, которые подавляют рост других микроорганизмов. Именно поэтому клубеньковые бактерии являются особенным объектом для исследования регуляции численности бактерий и источником для поиска новых антибактериальных соединений.
В работе мы убедились, что подавление роста конкурирующих бактерий ризобиями достаточно распространенное явление. При выращивании ризобий на богатых питательных средах, из общего количество, выбранных бактерий от 5 до 50% штаммов, в зависимости от растения-хозяина, выделяли в среду антибактериальные вещества. При этом, когда на газон бактерий была внесена живая культура ризобий, процент подавления становился незначительно выше, такое явление было заметно у бактерий, выделенных из чины весенней. В целом, штаммы R. leguminosarum проявляют наибольшую антибактериальную активность, в сравнении с R. phaseoli. Процент штаммов, которые синтезируют антибактериальные вещества, в какой-то степени соотносится с уровнем генетического разнообразия микросимбионтов популяции бобового растения. При изучении штаммов, обладающих антибактериальной активностью, на способность подавлять рост штамма E. coliATolC методом добавления живых ризобий оказался не очень эффективным, возможно это связано с более быстрым ростом именно E. coli.
Бактериоцины, которые продуцируют ризобии, могут играть значимую роль в пищевой промышленности для продления срока хранения продуктов, в медицине при лечении рака, также они могут в будущем заменить антибиотики в лечении патогенов с множественной лекарственной устойчивостью.
