ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. Характеристика бактерий рода Mycobacterium 8
1.2. Нетуберкулезные микобактерии 11
1.3. Микобактериозы 14
1.4. Распространенность микобактериозов 19
1.5. Рентгенографические исследования 23
1.6. Иммунологическая диагностика 25
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 27
2.1. Взятие биоматериала 27
2.2. Микроскопическое исследование 29
2.3. Культуральный метод 30
2.4. Технология MALDI-ToF MS 31
2.5. Выделение ДНК 31
2.6. Пан-микобактериальный 16S ген рРНК ПЦР 32
2.7. Широкоспектральная микобактериальная ПЦР 33
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 35
3.1. Анализ микроскопического исследования 35
3.2. Анализ культурального метода 35
3.3. Анализ технологии MALDI-ToF MS 36
3.4. Анализ молекулярно-генетической идентификации НТМ 37
3.5. Сравнительная характеристика методов идентификации микобактерий 37
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 39
ВЫВОДЫ 40
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 41
Актуальность исследования. Нетуберкулезные микобактерии (НТМ) появляются во всем мире как значимые причины хронической легочной инфекции, создавая ряд проблем как для клиницистов, так и для исследователей. Хотя в ряде исследований, проведенных во всем мире, со временем отмечается рост распространенности НТМ-легочной патологии, популяционные данные являются относительно скудными и подвержены систематическому искажению.
Нетуберкулезные микобактерии, в отличие от сложных видов микобактерий туберкулезного комплекса, являются бактериями, широко распространенными в окружающей среде, и могут быть обнаружены в водах водоемов, почв, водопроводов, пище, а также в больничных учреждениях (Philley JV, Griffith DE 2019). НТМ являются большой группой условно¬патогенных микроорганизмов, которые при условии сниженной иммунологической реакции могут вызывать тяжелые заболевания, что указывает на большую значимость идентификации бактерий (Prevos R., Marras T.K., 2015, Оттен Т.Ф.,1999). Патогенные НТМ нередко становятся причиной легочной инфекции (90% случаев), в тоже время внелегочные проявления могут поражать всевозможные ткани и органы, вызывая, лимфаденит, инфекции кожи, костей или мягких тканей, или могут быть рассеяны (Griffith D.E., T. Aksamit, B.A. Brown-Elliott,2017, Kasperbauer S, Huitt G, 2013).
Так как микобактериозы имеют схожую клиническую картину с туберкулезом. Из-за этой болезни, вызванные НТМ принимаются за различные формы туберкулезного поражения дыхательной системы человека. Еще одной причиной затруднения в определении возбудителя, является большое разнообразие видов, которые могут приводить к сходным заболеваниям, но при этом требовать различные методы лечения, что делает микробиологическую диагностику важной (Falkinham JO 3rd, 2013, Mazza- Stalder J, Jaton-Ogay K, Nicod L, 2009, Philley JV, Griffith DE 2019). Благодаря структурным особенностям, микобактерии устойчивы ко многим антибиотикам, поэтому требуется длительное лечение комбинацией нескольких антимикробных молекул, выбор которых основан на видовой идентификации и результатах тестирования чувствительности к антибиотикам (Philley JV, Griffith DE, 2019).
В 1960 году был разработан метод идентификации нетуберкулезных микобактерии, который основывался на определении формы и цвета колоний на плотной среде и биохимических свойствах микроорганизмов. Процесс культивирования микобактерий требует специальные среды и температуры. Мазок-исследование клинических образцов для выявления кислотоустойчивых бацилл исторически первый микробиологический тест для диагностики микобактериальной инфекции. Но, метод обладает ограниченной чувствительностью и специфичностью, а также не дает возможность определить вид. В частности, микроскопия мазка не позволяет отличить микобактерии туберкулеза от НТМ (Opota O, Senn L, Prod'hom G, Mazza-Stalder J, Tissot F, Greub G et al, 2016).
Учитывая важную этиологическую роль условно-патогенных нетуберкулезных микобактерий, неспецифические клинические проявления указывают на необходимость нахождений новых методов идентификации микобактерий и в разработки тест-систем.
Цель работы. Разработка способа молекулярно-генетической детекции основных клинически значимых представителей атипичных Mycobacterium spp.
Задачи исследования:
1. Анализ литературных данных и формирование реестра видов атипичных Mycobacterium spp., имеющих наибольшее значение для РФ.
2. Подбор оптимальных методов выделения ДНК и мишеней, применимых для молекулярно-генетической детекции атипичных Mycobacterium spp.
3. Оценка информативности молекулярно-генетической детекции атипичных Mycobacterium spp. в исследуемых образцах.
4. Анализ полученных литературных данных, сравнительная оценка частоты встречаемости отдельных видов атипичных Mycobacterium spp. в клинических образцах и ретроспективная характеристика эпидемиологических особенностей, связанных с ними заболеваний.
Научная новизна и теоретическая ценность работы. Новизна исследования заключается в изучении новых высокоспецифичных и чувствительных методов выделения и идентификации НТМ.
Научно-практическая значимость. Работа представляет научно-практический интерес, заключающийся в сравнительном изучении методов определения НТМ для последующей постановки правильного и точного диагноза.
Легочные заболевания, которые были вызваны нетуберкулезными микобактериями, в последнее время стали все более распространенными клиническими заболеваниям. Достижения в области визуализации и микробиологических методов, в частности молекулярный метод, значительно расширили наше понимание этого заболевания, но многие неопределенности остаются, особенно в эпидемиологии и клинической статистике.
Правильная видовая идентификация микобактерий становится все более важной, по мере появления данных об относительной склонности различных нетуберкулезных легочных заболеваний.
Проведенный обзор литературных источников показывает характеристику микобактерий, микобактериозов и разнообразных методов идентификации. Литературные данные позволили проанализировать ценность существующих методов. Систематизация методов в данной работе поможет в дальнейшем разработать более точные системы.
