Создание диагностического набора для количественного определения бактерий Klebsiella pneumoniae в клинических образцах

Перечень условных обозначений (сокращений) 3
ВВЕДЕНИЕ 4-5
ГЛАВА I. Обзор литературы 6
1.1. Характеристика Klebsiella pneumoniae 6-7
1.2. Клиническое значение 7-9
1.3. Микробиологическая диагностика 9-10
1.3.1 Бактериологический метод исследования 10-12
1.3.2 Серологический метод исследования 12-14
1.4. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 15-16
1.4.1 ПЦР в реальном времени (РТ-ПЦР) 16-18
ГЛАВА II. Материалы и методы 19
2.1. Материалы исследования 19-20
2.2. Культивирование и приготовление питательных сред для энтеробактерий:
Klebsiella pneumoniae и Escherichia coli 21-22
2.3. Выделение бактериальной ДНК из бактерии 22-23
2.4. Проведение стандартной полимеразной цепной реакции (ПЦР) 23-24
2.5. Детекция результатов ПЦР 24-25
2.6. Молекулярное клонирование 25-27
2.7. Выделение плазмидной ДНК 27-28
2.8. Метод серийных разведений 28
2.9. Подсчет концентрации ДНК 28
2.10. Проведение ПЦР в режиме реального времени (РТ-ПЦР) 29-30
Г ЛАВА III. Результаты и обсуждение 31
3.1. Конструирование калибратора для количественной оценки содержания Klebsiella pneumoniae 31 -34 3. 2. Перевод концентрации ДНК в ген-эквиваленты бактериальных клеток...34-
35
ВЫВОДЫ 35
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 36-42

Купить

Актуальность исследования. Klebsiella pneumoniae, входит в число представителей семейства Enterobacteriaceae, которые имеют широкое распространение в окружающей среде. Бактерии данного вида встречаются повсеместно в перстных и морских водах, в почве и на растениях, а также размножаются в слизистых оболочках тонкого кишечника, урогенитального тракта и верхних дыхательных путей (Bei Li, 2014). В Российской Федерации, как и во всем мире, K. pneumoniae вызывает обширный спектр заболеваний у людей. Микроорганизм вызывает инфекции дыхательных и мочевыводящих путей, поражает центральную нервную систему и желудочно-кишечный тракт, развивает бактериемию, кожный сепсис и первичные абсцесс печени (Hennequin, 2016). Бактерия также может вызывать у женщины после родов гнойно-воспалительные заболевания, у грудничков присутствие возбудителя проявляется в виде пневмонии, кишечной инфекции и токсико-септического состояния, которое не редко заканчивается летальным исходом (Николаева, 2016).
Ключевым источником K. pneumoniae является человек. Размножаясь на поверхностях слизистых оболочек, бактерия не всегда вызывает воспалительные процессы, поэтому считается условно-патогенным микроорганизмом. Обычно от 1 до 6% людей считаются носителями K. pneumoniae, пребывающих в носоглотке, от 5 до 38% являются носителями бактерии в кишечном тракте. Со слизистой оболочки микроорганизм может распространяться на другие ткани и органы, вызывая опасные для жизни инфекционные заболевания (Walter, 2018).
В связи с этим является весьма актуальным разработка тест системы не только для выявления возбудителя, но с возможностью количественного определения патогена в клинических образцах.
Цель исследования. Разработка способа ускоренной молекулярно-генетической количественной оценки Klebsiella pneumoniae в клинических образцах.
Задачи исследования.
1. Выделение ДНК Klebsiella pneumoniae, для последующего проведения ПЦР.
2. Амплификация и клонирование гена 16S рРНК в плазмидный вектор pAL- TA.
3. Создание серии разведений плазмидной ДНК и формирование молекулярно-генетического калибратора для РТ-ПЦР.
4. Перерасчет концентрации ДНК в количество бактериальных клеток.
Практическая значимость. Сконструирован молекулярно-биологический калибратор на основе плазмиды pAL-TA со вставкой участка гена 16S рРНК Klebsiella pneumoniae для количественной оценки бактерий в клинических образцах с помощью ПЦР в режиме реального времени.
Область применения результатов исследования. В диагностических исследованиях тест система с заранее известной концентрацией позволяет не только обнаружить возбудителя инфекции при постановке ПЦР в режиме реального времени, но и определить, количественное содержание патогенна в клиническом образце, путем сравнивания его с калибровочным образцом.

Купить