ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1. Бактериоцины 7
1.1.1 Бактериоцины грамположительных микроорганизмов 10
1.1.2. Бактериоцины грамотрицательных микроорганизмов 11
1.1.3. Пептидные бактериоцины 12
1.2. Клубеньковые бактерии 15
1.2.1. Регуляция численности бактерий в ризосфере и почве 19
1.3. Характеристика бактерий рода Rhizobium 23
1.4. Фазолицин 25
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 27
2.1. Объекты исследования 27
2.2. Методы исследования 27
2.2.1. Приготовление питательных сред для культивирования
клубеньковых бактерий 27
2.2.2. Оживление штаммов клубеньковых бактерий после
криохранения 29
2.2.3. Получение бактериального газона 30
2.2.4. Проведение скрининга штаммов ризобий фасоли на синтез
антимикробных соединений 30
2.2.5. Обработка бактерий флавоноидами 31
2.2.6. Постановка опыта с инокуляцией корней проростков фасоли
ризобиями 32
2.2.7. Выделение бактерий из клубеньков 33
2.2.8. Выделение ДНК из бактерий 33
2.2.9. RAPD-анализ 33
2.2.10. Электрофорез в агарозном геле 35
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 36
3.1. Определение оптимальных условий синтеза антибактериальных соединений штаммом Rhizobium sp. Pop5 36
3.1.1. Влияние различных pH на продукцию штаммом Rhizobium sp.
Pop5 антимикробных соединений 36
3.1.2. Влияние различного дрожжевого экстракта на продукцию
штаммом Rhizobium sp. Pop5 антимикробных соединений 37
3.1.3. Влияние различных источников углеводов на продукцию
штаммом Rhizobium sp. Pop5 антимикробных соединений 37
3.1.4. Влияние наличия других бактерий и их лизатов на продукцию
штаммом Rhizobium sp. Pop5 антимикробных соединений 39
3.1.5. Влияние флавоноидов на продукцию штаммом Rhizobium sp.
Pop5антимикробных соединений 40
3.2. Скрининг штаммов ризобий фасоли из коллекции «Симбионт» на
синтез соединений, подавляющих рост типовых и родственных штаммов ризобий 43
3.3. Оценка способности мексиканского штамма Rhizobium sp. Pop5
формировать клубеньки при конкурентном заражении семян фасоли обыкновенной с местными штаммами ризобий 44
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 47
ВЫВОДЫ 49
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 50
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 51
Клубеньковые бактерии - группа почвенных бактерий порядка Rhizobiales. Как правило, корневые и стеблевые клубеньковые бактерии симбиотически образуют клубеньки и фиксируют азот вместе с некоторыми фасолевыми растениями, обеспечивая источник азота для растений и снижая потребность в искусственных удобрениях, которые могут быть дорогими и вызывать экологические проблемы.
Устойчивость к высоким уровням засоления, а также выживаемость и устойчивость в суровых условиях пустыни делают эти ризобии очень ценным инокулятом для повышения продуктивности бобовых растений, выращиваемых в экстремальных условиях.
Актуальность темы.
Симбиотические азотфиксирующие бактерии (ризобии) конкурируют за образование клубеньков у растений-хозяев, используя различные механизмы, включая продукцию антимикробных соединений. Одним из таких соединений является бактериоцин - фазолицин, который синтезируется штаммом Rhizobium sp. Pop5.
Данный штамм был выделен из клубеньков фасоли обыкновенной (Phaseolus vulgaris), произрастающей в Мексике в тропическом лесу в регионе Лос Тукстлас.
Фазолицин представляет собой пептид, который блокирует работу рибосом лишь некоторых бактерий порядка Rhizobiales. Поскольку данное антимикробное соединение обладает таким избирательным действием, представляется интересным оценить его влияние на рост штаммов ризобий, изолированных из клубеньков бобовых растений, произрастающих на территории Республики Башкортостан.
Целью данной работы является исследовать способность мексиканского штамма Rhizobium sp. Pop5, продуцирующего пептидный бактериоцин - фазолицин, подавлять рост ризобий фасоли, изолированных из почв Республики Башкортостан.
Задачи:
1. Отработать методику культивирования бактерий штамма Rhizobium sp. Pop5 для определения оптимальных условий синтеза антибактериальных соединений.
2. Провести скрининг штаммов ризобий фасоли из коллекции «Симбионт» на синтез соединений, подавляющих рост типовых и родственных штаммов ризобий.
3. Оценить подавление роста клубеньковых бактерий между местными штаммами бактерий фасоли и мексиканским штаммом Rhizobium sp. Pop5.
Клубеньковые бактерии (ризобии), вступающие в азотфиксирующий симбиоз с бобовыми, конкурируют за образование клубеньков у растений- хозяев, используя различные механизмы, включая продукцию антимикробных соединений. Одним из таких соединений является бактериоцин - фазолицин, который синтезируется штаммом Rhizobium sp. Pop5.
Нами показано, что мексиканский штамм Rhizobium sp. Pop5. хорошо растет на среде RM при pH = 6.8 в течение двух суток и спонтанно синтезирует вещества, подавляющие рост родственных штаммов ризобий. Подбор дрожжевого экстракта показал, что при использовании в составе питательной среды дрожжевого экстракта, содержащего аминный азот >3,0% - ореол подавления роста был четче. Нами выявлено, что никакого влиянии различных источников углеводов на продукцию антимикробных соединений штаммом Pop5 не отмечается. При исследовании влияния наличия других бактерий и их лизатов на продукцию штаммом Rhizobium sp. Pop5 антимикробных соединений, результаты показали, что видимых различий также нет. В отличие от ризобий Rhizobium leguminosarum, усиления синтеза антибактериальных соединений при обработке растительными флавоноидами не наблюдается.
Следующим этапом анализа был скрининг штаммов ризобий фасоли из коллекции «Симбионт» на синтез соединений, подавляющих рост типовых и родственных штаммов ризобий. В ходе исследований были получены следующие данные: 10 исследованных штаммов, выделенных из клубеньков фасоли обыкновенной, не обладали антимикробной активностью как против Rhizoboum phaseoli (PVu2) своего рода, так и родственного штамма Rhizobium leguminosarum (ГЛ9).
Заключительным этапом анализа являлась оценка способности мексиканского штамма Rhizobium sp. Pop5 формировать клубеньки при конкурентном заражении семян фасоли обыкновенной с местными штаммами ризобий. Исследование показало, что в конкурентной борьбе ризобии продуцируют свой бактериоцин. Но при оценке подавление роста клубеньковых бактерий между местными штаммами бактерий фасоли и мексиканским штаммом Rhizobium sp. Pop5. данные результата показывает, что Rhizobium sp. Pop5. не подавляет рост местных клубеньковых бактерий, но активно конкурирует с ними за образование клубеньков, о чем свидетельствует процентный расчет RAPD-анализа, Pop5 составляет 55,6%, PVu6 33,3%, St4 11,1%, St5 0%.
Фазолицин, продуцируемый Rhizobium sp. Pop5, представляет интерес не только как регулятор численности ризобий, но и как перспективная антибактериальная молекула для создания новых антибиотиков.
