СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1. Семейство Picornaviridae 7
Общая характеристика семейства Picornaviridae 7
Жизненный цикл 9
Стратегии подавления иммунного ответа 11
1.2. Род Cardivirus вирус EMCV 13
Общая характеристика вируса EMCV 14
Жизненный цикл 15
Эпидемиология 17
Лидерный белок 19
2А белок 20
1.3. Методы получения рекомбинантных белков 20
Подбор экспрессионной системы 21
Молекулярное клонирование 22
Выделение и очистка рекомбинантных белков 26
Хроматографическая очистка белка 28
1.4. Получение рекомбинантных белков пикорнавирусов 34
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 40
2.1. Материалы 40
2.1.1. Ферменты и реактивы 40
2.1.2. Биологические материалы 40
2.2. Лабораторное оборудование 40
2.3. Методы 41
2.3.1. Полимеразная цепная реакция 41
2.3.2. Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле 41
2.3.3. Рестрикция ДНК 42
2.3.4. Препаративный электрофорез, выделение и очистка фрагментов
ДНК 42
2.3.5. Лигирование 42
2.3.6. Получение плазмидной ДНК 42
2.3.7. Секвенирование последовательностей ДНК методом Сэнгера 43
2.3.8. Индукция экспрессии 43
2.3.9. Электрофорез белков в денатурирующих условиях 44
2.3.10. Выделение и очистка рекомбинантного белка 45
2.3.11. Дот блот анализ проб 46
2.3.12. Вестерн-блот-гибридизация 46
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 47
3.1. Создание генно-инженерной конструкции, кодирующей L белок, на
основе плазмиды pQE-31 49
3.2. Культивирование трансформированье колоний с индукцией синтеза
белка 51
3.7. Выделение и очистка белка 53
3.5. Создание генно-инженерной конструкции, кодирующей L белок, на
основе плазмиды pHEN 54
3.6. Культивирование трансформированных колоний с индукцией синтеза
белка 55
3.7. Выделение и очистка белка 57
Обсуждение результатов 58
ВЫВОДЫ 60
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 61
Вирус энцефаломиокардита принадлежит к роду Cardiovirus семейства Picornaviridae. Данное семейство представляет собой небольшие безоболочечные вирусы с оц(+)РНК-геномом, которые инфицируют широкий круг хозяев [1]. Вирус EMCV более известен как вирус грызунов, однако способен вызывать энцефалиты, миокардиты, серьезные неврологические нарушения у многих видов млекопитающих, является потенциальным зоонозным патогеном [2].
Лидерный белок вируса энцефаломиокардита является секьюрити- белком, основная функция которого — противодействие защитным механизмам клетки [3]. L способен подавлять выработку интерферонов 1-го типа и нарушать ядерно-цитоплазматический транспорт веществ, связываясь с Ran-GTP-фазой, которая необходима для транспорта белков и РНК через ядерные поры [4]. Известно, что данный белок влияет на клеточную гибель вызывая апоптоз или некроз, или апоптозоподобную смерть на разных клеточных линиях [3]. Кроме того, лидерный белок может влиять на везикулярный транспорт, тем самым способствуя выходу вирусных частиц из зараженной клетки и дальнейшему распространению инфекции [5]. Однако, функции и локализация лидерного белка в клетке при вирусной инфекции на данный момент до конца не изучены. Исследование механизмов воздействия EMCV на врожденный иммунный ответ, в перспективе, поможет разработать стратегию защиты от вирусной инфекции на стадии транскрипции и трансляции вирусного генома.
В связи с этим актуальной задачей является разработка систем бактериальной экспрессии лидерного белка вируса энцефаломиокардита для последующего изучения его функций в развитии патологии.
Целью данной работы является получение лидерного белка вируса энцефаломиокардита.
В соответствии с заданной целью были сформированы следующие задачи:
1. Создание генно-инженерных конструкций, экспрессирующих L белок EMCV;
2. Индукция экспрессии L белка EMCV в бактериальной системе;
3. Выделение и очистка L белка EMCV.
1. Созданы генно-инженерные конструкции для экспрессии 6xHis-L EMCV, на основе плазмид pQE31 и pHEN.
2. Подобраны условия и проведена экспрессия 6xHis-L EMCV в
бактериальных клетках.
3. Проведена очистка рекомбинантного белка 6xHis-L EMCV с
использованием металл-хелатной аффинной хроматографии. Проведен расчет массы рекомбинантного белка после очистки. Выход конечного продукта составил 8,46 мг.
