ПРОТЕОМНОЕ ПРОФИЛИРОВАНИЕ СЕКРЕТОМА КЛИНИЧЕСКОГО ИЗОЛЯТА ЭНТЕРОТОКСИГЕННОГО ШТАММА BACTEROIDES FRAGILIS
|
Введение 4
Глава 1. Литературный обзор 7
1.1 Общая характеристика рода Bacteroides 7
1.2 Особенности секреторной активности рода Bacteroides 9
1.3 Система бактериальной секреции VI типа 16
1.4 Генетическая структура VI типа бактериальной секреции 20
1.5 Система секреции VI типа у Bacteroides 21
Глава 2. Материалы и методы 25
2.1 Бактериальные штаммы и клеточные культуры 25
2.2 Выделение везикул 25
2.3 Выделение среды и клеточного осадка 26
2.4 Электронная микроскопия препарата везикул и клеток 26
2.5 Фракционирование клеточного лизата 27
2.6 Геномное сравнение штаммов 28
2.7 Выделение белка и электрофорез 28
2.8 Протеомное исследование везикул и клеточных фракций методом
ВЭЖХ-МС/МС 29
2.8.1 Пробоподготовка 29
2.8.2 Параметры измерения для протеомного анализа везикул 30
2.8.3 Идентификация белков и пептидов 30
2.9 Протеогеномное профилирование 31
Глава 3. Результаты и обсуждение 32
3.1 Протеогеномное профилирование 32
3.1.1 Полногеномная и протеогеномная аннотации изучаемых
штаммов B. fragilis 32
3.1.2 Протеогеномное профилирование аппарата секреции VI типа для
штамма BOB25 B. fragilis 34
3.2 Культивирование B. fragilis и особенности основных этапов
пробоподготовки 37
3.2.1 Определение оптимальной фазы роста бактерий 37
3.2.2 Оценка качества исследуемых образцов 38
3.2.3 Электронная микроскопия препаратов среды, везикул и бактерий 39
3.2.4 Валидация протеомной пробоподготовки везикул 40
3.3 Результаты протеомного профилирования 42
3.3.1 Протеомное профилирование основных структурных компонентов VI типа секреции 42
3.3.2 Протеомное профилирование пар иммунопротектор - эффектор
46
3.3.3 Активация “кворум-сенсинга” в условиях конкурентной борьбы 47
Заключение 50
Список использованных источников 54
Глава 1. Литературный обзор 7
1.1 Общая характеристика рода Bacteroides 7
1.2 Особенности секреторной активности рода Bacteroides 9
1.3 Система бактериальной секреции VI типа 16
1.4 Генетическая структура VI типа бактериальной секреции 20
1.5 Система секреции VI типа у Bacteroides 21
Глава 2. Материалы и методы 25
2.1 Бактериальные штаммы и клеточные культуры 25
2.2 Выделение везикул 25
2.3 Выделение среды и клеточного осадка 26
2.4 Электронная микроскопия препарата везикул и клеток 26
2.5 Фракционирование клеточного лизата 27
2.6 Геномное сравнение штаммов 28
2.7 Выделение белка и электрофорез 28
2.8 Протеомное исследование везикул и клеточных фракций методом
ВЭЖХ-МС/МС 29
2.8.1 Пробоподготовка 29
2.8.2 Параметры измерения для протеомного анализа везикул 30
2.8.3 Идентификация белков и пептидов 30
2.9 Протеогеномное профилирование 31
Глава 3. Результаты и обсуждение 32
3.1 Протеогеномное профилирование 32
3.1.1 Полногеномная и протеогеномная аннотации изучаемых
штаммов B. fragilis 32
3.1.2 Протеогеномное профилирование аппарата секреции VI типа для
штамма BOB25 B. fragilis 34
3.2 Культивирование B. fragilis и особенности основных этапов
пробоподготовки 37
3.2.1 Определение оптимальной фазы роста бактерий 37
3.2.2 Оценка качества исследуемых образцов 38
3.2.3 Электронная микроскопия препаратов среды, везикул и бактерий 39
3.2.4 Валидация протеомной пробоподготовки везикул 40
3.3 Результаты протеомного профилирования 42
3.3.1 Протеомное профилирование основных структурных компонентов VI типа секреции 42
3.3.2 Протеомное профилирование пар иммунопротектор - эффектор
46
3.3.3 Активация “кворум-сенсинга” в условиях конкурентной борьбы 47
Заключение 50
Список использованных источников 54
Актуальность работы
Представители рода Bacteroides относятся к грамотрицательным облигатно анаэробным бактериям, устойчивым к воздействию солей желчных кислот [17, 45, 63, 92, 98, 111]. В спектр их функциональной активности относят такие уникальные свойства, как ферментация сложных углеводов, протеолиз поверхностных клеточных белков, биотрансформации солей желчных кислот. Род Bacteroides характеризуется значительным разнообразием бактериальных видов, однако один из представителей рода - Bacteroides fragilis обладает уникальными свойствами. Нетоксигенные штаммы данного вида способны модулировать иммунный ответ в ходе воспалительной реакции, а также регулировать численность патогенной флоры [21, 72, 90, 96]. Таким образом нетоксигенные штаммы данного вида являются бактериями-комменсалами, помогая поддерживать разнообразие микробиоты кишечника [29, 44, 68, 69]. Токсигенные штаммы, напротив, выделяют токсин фрагилизин, который способствует развитию воспаления кишечника путём повреждения межклеточного белка Е-кадгерина [112]. Кроме того, в ходе последних исследований, стало понятно, что фрагилизин оказывает непосредственное влияние на генетические каскады и через ряд опосредующих факторов способствует секреции цитокинов, что способствует онкогенезу [85]. Удивительно большое количество потенциальных функциональных характеристик B. fragilis минимально состыкуется с его секреторным потенциалом.
Тогда как для большинства бактериальных видов известно порядка семи бактериальных типов секреции, включая различные подтипы, для Bacteroides fragilis до 2014 года данных о наличие указанных типов бактериальной секреции в литературе представлено не было . Единственным способом секреции длительное время рассматривались только везикул - моноламиллярные структуры с полифункциональным содержимым, выделяемым бактериальной 4
клеткой в ходе жизнедеятельности. Тем не менее, подробный всесторонний анализ везикул B. fragilis позволил выявить в составе данных структур фрагилизин. Кроме того, протеометаболомное профилирование, выполненное впервые для бактериальных везикул, позволило охарактеризовать спектр биохимических реакций, внеклеточная активность которых была доказана методами флаксомного анализа. Помимо этого, в ходе исследований генома B. fragilis методами биоинформатического анализа удалось идентифицировать VI тип бактериальной секреции.
Отличительной особенностью VI типа секреции является необходимость использования данного способа исключительно для внутривидовой конкуренции. Для этого в структуре шестого типа секреции присутствует структура, напоминающая шприц, на конце которой локализуется повреждающий клетку-оппонента белок-эффектор [74]. В атакуемой клетке при этом имеются белки-иммунопротекторы, которые способны инактивировать эффекторы и снизить токсическую нагрузку на клетку в ходе конкурентной борьбы. По-видимому, не существует механизма, который позволил бы отличать свои белки от чужих, поэтому иммунопротекторы также защищают клетку- продуцента от токсического действия своего же эффектора, образуя пару эффектор - иммунный белок (E-I) [43, 76]. При этом наличие генов иммунных белков вне аппарата T6SS у других бактерий даёт им преимущество в борьбе с антагонизмом B. fragilis, обусловленным T6SS [101].
Важно отметить, что шестой тип секреции изучается достаточно давно, но для B. fragilis он стал известен лишь в 2016 году [12]. В 2017 году была охарактеризована генетическая структура локуса, кодирующего T6SS B. fragilis. В литературе также приведены функциональные тесты данного типа секреции для B. fragilis, однако полного протеомного профилирования для основных и вариабельных структур T6SS B. fragilis выполнено не было. Важно отметить, что полученные знания могут существенно дополнить имеющуюся в литературе информацию и определить новые спектры функциональной активности данного способа бактериальной секреции для B. fragilis. Исходя из необходимости проведения протеомного профилирования VI типа бактериальной секреции для B. fragilis были сформулированы цель и задачи настоящего исследования:
Цель исследования
Поиск основных компонентов VI типа бактериальной секреции во фракционированном секретоме токсигенного штамма Bacteroides fragilis.
Задачи исследования
1. Провести протеогеномную аннотацию и сравнительное геномное исследование локусов, кодирующих аппарат бактериальной секреции токсигенного штамма B. fragilis - BOB25;
2. Разработать методику получения и анализа препаратов белков клеточного лизата, культуральной среды и препарата везикул токсигенного штамма B. fragilis;
3. Провести протеомное исследование препарата везикул, клеточного лизата и культуральной среды токсигенного штамма B. fragilis методом высокоэффективной жидкостной хроматографии - масс-спектрометрии (ВЭЖХ- МС/МС);
4. Определить в составе исследуемых препаратов эффекторы и белки иммунной защиты токсигенного штамма B. fragilis.
Представители рода Bacteroides относятся к грамотрицательным облигатно анаэробным бактериям, устойчивым к воздействию солей желчных кислот [17, 45, 63, 92, 98, 111]. В спектр их функциональной активности относят такие уникальные свойства, как ферментация сложных углеводов, протеолиз поверхностных клеточных белков, биотрансформации солей желчных кислот. Род Bacteroides характеризуется значительным разнообразием бактериальных видов, однако один из представителей рода - Bacteroides fragilis обладает уникальными свойствами. Нетоксигенные штаммы данного вида способны модулировать иммунный ответ в ходе воспалительной реакции, а также регулировать численность патогенной флоры [21, 72, 90, 96]. Таким образом нетоксигенные штаммы данного вида являются бактериями-комменсалами, помогая поддерживать разнообразие микробиоты кишечника [29, 44, 68, 69]. Токсигенные штаммы, напротив, выделяют токсин фрагилизин, который способствует развитию воспаления кишечника путём повреждения межклеточного белка Е-кадгерина [112]. Кроме того, в ходе последних исследований, стало понятно, что фрагилизин оказывает непосредственное влияние на генетические каскады и через ряд опосредующих факторов способствует секреции цитокинов, что способствует онкогенезу [85]. Удивительно большое количество потенциальных функциональных характеристик B. fragilis минимально состыкуется с его секреторным потенциалом.
Тогда как для большинства бактериальных видов известно порядка семи бактериальных типов секреции, включая различные подтипы, для Bacteroides fragilis до 2014 года данных о наличие указанных типов бактериальной секреции в литературе представлено не было . Единственным способом секреции длительное время рассматривались только везикул - моноламиллярные структуры с полифункциональным содержимым, выделяемым бактериальной 4
клеткой в ходе жизнедеятельности. Тем не менее, подробный всесторонний анализ везикул B. fragilis позволил выявить в составе данных структур фрагилизин. Кроме того, протеометаболомное профилирование, выполненное впервые для бактериальных везикул, позволило охарактеризовать спектр биохимических реакций, внеклеточная активность которых была доказана методами флаксомного анализа. Помимо этого, в ходе исследований генома B. fragilis методами биоинформатического анализа удалось идентифицировать VI тип бактериальной секреции.
Отличительной особенностью VI типа секреции является необходимость использования данного способа исключительно для внутривидовой конкуренции. Для этого в структуре шестого типа секреции присутствует структура, напоминающая шприц, на конце которой локализуется повреждающий клетку-оппонента белок-эффектор [74]. В атакуемой клетке при этом имеются белки-иммунопротекторы, которые способны инактивировать эффекторы и снизить токсическую нагрузку на клетку в ходе конкурентной борьбы. По-видимому, не существует механизма, который позволил бы отличать свои белки от чужих, поэтому иммунопротекторы также защищают клетку- продуцента от токсического действия своего же эффектора, образуя пару эффектор - иммунный белок (E-I) [43, 76]. При этом наличие генов иммунных белков вне аппарата T6SS у других бактерий даёт им преимущество в борьбе с антагонизмом B. fragilis, обусловленным T6SS [101].
Важно отметить, что шестой тип секреции изучается достаточно давно, но для B. fragilis он стал известен лишь в 2016 году [12]. В 2017 году была охарактеризована генетическая структура локуса, кодирующего T6SS B. fragilis. В литературе также приведены функциональные тесты данного типа секреции для B. fragilis, однако полного протеомного профилирования для основных и вариабельных структур T6SS B. fragilis выполнено не было. Важно отметить, что полученные знания могут существенно дополнить имеющуюся в литературе информацию и определить новые спектры функциональной активности данного способа бактериальной секреции для B. fragilis. Исходя из необходимости проведения протеомного профилирования VI типа бактериальной секреции для B. fragilis были сформулированы цель и задачи настоящего исследования:
Цель исследования
Поиск основных компонентов VI типа бактериальной секреции во фракционированном секретоме токсигенного штамма Bacteroides fragilis.
Задачи исследования
1. Провести протеогеномную аннотацию и сравнительное геномное исследование локусов, кодирующих аппарат бактериальной секреции токсигенного штамма B. fragilis - BOB25;
2. Разработать методику получения и анализа препаратов белков клеточного лизата, культуральной среды и препарата везикул токсигенного штамма B. fragilis;
3. Провести протеомное исследование препарата везикул, клеточного лизата и культуральной среды токсигенного штамма B. fragilis методом высокоэффективной жидкостной хроматографии - масс-спектрометрии (ВЭЖХ- МС/МС);
4. Определить в составе исследуемых препаратов эффекторы и белки иммунной защиты токсигенного штамма B. fragilis.
Значительные успехи на пути исследований основ функциональной активности микрофлоры способствуют разработке различных вариантов пробиотической терапии при воспалительных заболеваниях кишечника. С другой стороны, системное описание патогенетических основ указанных заболеваний в аспекте влияния отельных мажорных представителей является одним из способов подбора таргетных препаратов. Являясь одним из доминантных родов, Bacteroides оказывают существенное влияние как на формирование межбактериального гомеостаза, так и провоцируют воспалительные заболевания, являясь продуцентами токсинов и факторов вирулентности. Исследуя способы внутри- и межпопуляционного взаимодействия бактерий, можно изучить точные механизмы формирования качественного и количественного баланса бактериальных видов, являющегося основой формирования здоровой микрофлоры ЖКТ. Функциональная активность бактерий во многом определяется возможностями секреторных аппаратов, которых на сегодняшний день насчитывается 7 видов. Для представителей наиболее много численного рода среди основных энтеротипов бактерий - рода Bacteroides - подробно изучены везикулы как способ доставки различных компонентов внутри и меж популяций, а также до клеток кишечника человека. Однако, возможность доминирования в составе микрофлоры определяется способностью противостоять различным бактериальным видам в условиях конкурентной борьбы. Система VI типа бактериальной секреции, описанная методами биоинформатического анализа у представителей рода Bacteroides, является одним из наиболее удобных способов для осуществления конкурентной борьбы. Известна генетическая структура данного типа у Bacteroides, однако, существует значительное количество вариабельных участков, кодирующих так называемые белки-эффекторы, оказывающие повреждающее действие, и иммунопротекторы, защищающие клетки от собственных и чужеродных эффекторных белков. Для каждого бактериального вида, имеющего VI тип бактериальной секреции, пары эффектор- иммунопротектор могут быть сформированы индивидуально, поэтому изучение данных комбинаций у наиболее значимых представителей может способствовать детальному пониманию механизмов конкурентной борьбы.
В данной работе для подробного изучения структур VI типа бактериальной секреции был выбран один из самых ярких представителей рода - Bacteroides fragilis. Имеющаяся в литературе информация о геномном составе локуса, кодирующего данный тип секреции, в настоящем исследовании была дополнена протеомными данными. Было показано, что в препаратах фракционированного секретома клинического изолята Bacteroides fragilis, культивируемого в лабораторных условиях, представлено большинство компонентов VI типа секреции. Возможность выявления данных структур вне конкурентных взаимодействий можно проецировать на описанный в литературе эффект “бактериальной памяти”, поскольку для референсного штамма в схожих вариантах проб такого количества компонентов обнаружено не было.
Кроме компонентов аппарата секреции VI типа в составе секретома были выявлены белки-иммунопротекторы и эффекторы, что также подтверждает активность VI типа секреции у изучаемого штамма. Однако важным наблюдением стало обнаружение белка-иммунопротектора VU15_RS08380 в составе везикул. В работе предложены несколько способов возможной ассоциации иммунопротектора с везикулами, однако важным является факт потенциального использования данного белка в качестве сигнальной молекулы для всей популяции в случае внезапного нападения со стороны представителей другого бактериального штамма Bacteroides fragilis. Описанные в ходе данной работы явления нуждаются в дополнительных доказательных экспериментах. Они имеют высокую значимость для дальнейшего понимания особенностей функциональной активности VI типа секреции у бактерий. Суммарно полученные протеомные данные дополняют результаты генетического исследования аппарата секреции VI типа у представителей рода Bacteroides и открывают дополнительные возможности для исследования функциональной активности данного способа секреции у бактерий.
Выводы:
1. В ходе сравнительной протеогеномной аннотации генетических локусов, кодирующих аппарат бактериальной секреции токсигенного и референсных штаммов B. fragilis, из базы данных NCBI, были определены гомологичные участки, ответственные за формирование белков VI типа секреции. На основании данных протеогеномного профилирования для токсигенного штамма B. fragilis составлена база триптических пептидов для идентификации белков VI типа секреции;
2. Сравнительное электрофоретическое исследование препарата везикул и фракционированного клеточного лизата в ПААГ, дополненное данными электронной микроскопии, подтвердили эффективность использованного протокола выделения везикул. Методы трансмиссионной электронной микроскопии позволили выявить в составе препарата культуральной среды специфический для VI типа бактериальной секреции белок - Hcp, свидетельствующий об активности данного типа секреции у исследуемого токсигенного штамма B. fragilis;
3. Посредством протеомного анализа фракционированного секретома,
включающего препараты везикул и культуральной среды, а также исследования образцов клеточного лизата токсигенного штамма B. fragilis методом ВЭЖХ- МС/МС было идентифицировано значительное количество белков, среднее количество которых для каждого препарата составило: для везикул (п = 16) -
142, для культуральной среды (п = 5) - 111, для бактериального лизата (п = 4) - 481. Полученные количественные данные согласуются с литературными для использованного способа пробоподготовки и анализа препаратов. Среди достоверно идентифицированных белков выявлены компоненты T6SS, общее количество которых составило для препарата везикул - 50, клеточного лизата - 16 и среды - 16;
4. В составе исследуемых препаратов везикул, культуральной среды и бактериального лизата токсигенного штамма B. fragilis были определены белки иммунной защиты и эффекторы. В препарате везикул был обнаружен иммунопротекторный белок VU15_RS08380. Предложена гипотеза доставки иммунопротекторного белка VU15_RS08380 в составе везикул до бактерий, составляющих основу популяции данного вида и активации “кворум-сенсинга” в условиях конкурентной борьбы.
В данной работе для подробного изучения структур VI типа бактериальной секреции был выбран один из самых ярких представителей рода - Bacteroides fragilis. Имеющаяся в литературе информация о геномном составе локуса, кодирующего данный тип секреции, в настоящем исследовании была дополнена протеомными данными. Было показано, что в препаратах фракционированного секретома клинического изолята Bacteroides fragilis, культивируемого в лабораторных условиях, представлено большинство компонентов VI типа секреции. Возможность выявления данных структур вне конкурентных взаимодействий можно проецировать на описанный в литературе эффект “бактериальной памяти”, поскольку для референсного штамма в схожих вариантах проб такого количества компонентов обнаружено не было.
Кроме компонентов аппарата секреции VI типа в составе секретома были выявлены белки-иммунопротекторы и эффекторы, что также подтверждает активность VI типа секреции у изучаемого штамма. Однако важным наблюдением стало обнаружение белка-иммунопротектора VU15_RS08380 в составе везикул. В работе предложены несколько способов возможной ассоциации иммунопротектора с везикулами, однако важным является факт потенциального использования данного белка в качестве сигнальной молекулы для всей популяции в случае внезапного нападения со стороны представителей другого бактериального штамма Bacteroides fragilis. Описанные в ходе данной работы явления нуждаются в дополнительных доказательных экспериментах. Они имеют высокую значимость для дальнейшего понимания особенностей функциональной активности VI типа секреции у бактерий. Суммарно полученные протеомные данные дополняют результаты генетического исследования аппарата секреции VI типа у представителей рода Bacteroides и открывают дополнительные возможности для исследования функциональной активности данного способа секреции у бактерий.
Выводы:
1. В ходе сравнительной протеогеномной аннотации генетических локусов, кодирующих аппарат бактериальной секреции токсигенного и референсных штаммов B. fragilis, из базы данных NCBI, были определены гомологичные участки, ответственные за формирование белков VI типа секреции. На основании данных протеогеномного профилирования для токсигенного штамма B. fragilis составлена база триптических пептидов для идентификации белков VI типа секреции;
2. Сравнительное электрофоретическое исследование препарата везикул и фракционированного клеточного лизата в ПААГ, дополненное данными электронной микроскопии, подтвердили эффективность использованного протокола выделения везикул. Методы трансмиссионной электронной микроскопии позволили выявить в составе препарата культуральной среды специфический для VI типа бактериальной секреции белок - Hcp, свидетельствующий об активности данного типа секреции у исследуемого токсигенного штамма B. fragilis;
3. Посредством протеомного анализа фракционированного секретома,
включающего препараты везикул и культуральной среды, а также исследования образцов клеточного лизата токсигенного штамма B. fragilis методом ВЭЖХ- МС/МС было идентифицировано значительное количество белков, среднее количество которых для каждого препарата составило: для везикул (п = 16) -
142, для культуральной среды (п = 5) - 111, для бактериального лизата (п = 4) - 481. Полученные количественные данные согласуются с литературными для использованного способа пробоподготовки и анализа препаратов. Среди достоверно идентифицированных белков выявлены компоненты T6SS, общее количество которых составило для препарата везикул - 50, клеточного лизата - 16 и среды - 16;
4. В составе исследуемых препаратов везикул, культуральной среды и бактериального лизата токсигенного штамма B. fragilis были определены белки иммунной защиты и эффекторы. В препарате везикул был обнаружен иммунопротекторный белок VU15_RS08380. Предложена гипотеза доставки иммунопротекторного белка VU15_RS08380 в составе везикул до бактерий, составляющих основу популяции данного вида и активации “кворум-сенсинга” в условиях конкурентной борьбы.
