ВВЕДЕНИЕ 2
Актуальность исследования 2
Цель исследования 3
Задачи исследования 3
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 4
1.1 Организация генома прокариот 4
1.2 ГОРИЗОНТАЛЬНЫЙ ПЕРЕНОС ГЕНОВ 10
1.3 РЕКОМБИНАЦИЯ БАКТЕРИЙ 12
1.4 СПОСОБЫ ДОЛГОВРЕМЕННОГО ХРАНЕНИЯ БАКТЕРИЙ 17
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 20
2.1 Объект исследования 20
2.2. Использованные реактивы 20
2.3 Оборудование 21
2.4 Приготовление жидких питательных сред для культур E.Coli и
R.Leguminosarum 23
2.5. Приготовление плотных питательных сред для культур E.Coli и R.Leguminosarum 24
2.6 Посев на жидкую питательную среду 25
2.7 Посев на плотную питательную среду 26
2.8 Лиофилизация 27
2.9. Выделение бактериальной ДНК из бактерии 28
2.10. Проведение полимеразной цепной реакции 29
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 32
ВЫВОДЫ 39
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 40
Актуальность исследования.
Лиофилизация является одним из основных способов продолжительного хранения биоматериала. Он используется во многих областях, начиная от пищевой индустрии и фармацевтики и заканчивая генетическими банками, создаваемыми для длительного хранения генетической информации. Хранения методом лиофилизации, позволяет сохранять образцы вплоть до 50 лет, при соблюдении всех необходимых условий.
Однако метод обладает достаточно крупными минусами. Лиофилизация для протекания необходимость в наличие дорогостоящего тяжёлого оборудования, а также свои нюансы на этапе подготовки при организации протективных мер, для сохранения заготавливаемого субстрата.
Лиофилизация проводится в условиях пониженного давления и температуре ниже тройной точки воды, что обеспечивает сублимацию льда, позволяя ему перейти в парообразное состояние, минуя жидкую фазу. Подготовленную среду подвергают глубокой заморозке, затем вся жидкость удаляется из продукта, оставляя лишь осадок состоящий из высушенного исходного материала.
Бактерии, в процессе подвергаются огромному стрессу, испытывая колоссальную физическую нагрузку, подвергаясь воздействию опасных механических процессов. Данная нагрузка может приводить как к механическим повреждениям клетки в отсутствии криопротекторов, так и приводить в действие процессы, действие которых может привести к потери генетической информации, что может стать проблемой при последующем использовании данных культур.
В связи с этим является весьма актуальным выяснить степень изменения генетической информации внутри клетки после воздействия на неё методом лиофилизации и определения необходимости проведения контроля генетической информации после каждого оживления культуры Исследования проводились в соответствии с методикой работы в лабораторных условиях с соблюдением стерильных условий и техники безопасности в рамках сохранения целостности эксперимента.
Цель исследования.
Выявить влияние способа лиофилизации на внутреннюю рекомбинационную активность бактерий, ведущую к изменению их фенотипа.
Задачи исследования.
1. Получить флуоресцентно меченные лабораторные штаммы E. coli XL-Blue и дикие штаммы клубеньковых бактерий, R.leguminosarum ГЛ9 путем трансформации их плазмидным вектором, несущим гены флуоресцентного белков.
2. С использованием маркированных штаммов E.coli, выявить стабильность мобильной части генома бактерий при обычном культивировании на питательных средах.
3. Провести сравнительный анализ влияния лиофилизации на потери маркерных фенотипических признаков, детерминированных на плазмиде лабораторных штаммов бактерий и диких вариантов микроорганизмов.
1. Долговременное хранение бактерий способом лиофилизации и последующая регенерация их на питательной среде могут привести к изменению генотипа микроорганизмов за счет внутренней рекомбинации или элиминации плазмид микроорганизмов, что может привести к изменению их фенотипа
2. При элиминации плазмид в колонии бактерий это происходит не во всех клетках, и колония может восстановить свой исходный фенотип при появлении селектирующего фактора.
3. Применения для долговременного хранения бактерий способа лиофилизации является действенным методом при последующем скрининге бактерий с первоначальным фенотипом.
