ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6
1.1. Характеристика рода Agrobacterium 6
1.1.1. Род Agrobacterium Rhizobium, физиологические и генетические
свойства, таксономическое положение, разнообразие, основные представители - патогены растений 7
1.1.2. Систематическое положение Agrobacterium 8
1.1.3. Физиологические признаки Agrobacterium 9
1.1.4. Вирулентность и распространение бактерий рода Agrobacterium ... 12
1.1.5. Геном штамма К599 Agrobacterium 13
бактерий рода Agrobacterium в генной инженерии 14
1.2.1. Трансформация растений агробактериями 15
1.2.2. Методы получения культуры волосовидных корней 16
1.3. Сладкий белок браззеин 17
1.4. Применение волосовидных корней в биотехнологической
промышленности 19
1.4.1. Применение культур волосовидных корней в фармацевтической
промышленности 20
1.4.2. Применение волосовидных корней в биотехнологии и
промышленности 20
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 22
2.1. Объекты исследования 22
2.2. Приборы 22
2.3. Составы сред 23
2.4. Создание рекомбинантных векторов для проведения
агробактериальной трансформации 24
2.5. Трансформация компетентных клеток E.coli плазмидной ДНК 27
2.6. Выделение и очистка плазмидной ДНК методом щелочного лизис 27
2.7. Выделение тотальной ДНК E.coli при пемощи 5%-ного тритона Х-
100 для ПЦР-анализа 29
2.8. Полимеразная цепная реакция 29
2.9. Агарозный гель-электрофорез 31
2.10. Электропорация компетентных клеток Agrobacterium rhizogenes
штамма К599, А4, К15834 32
2.11. Стерилизация корнеплода моркови 33
2.12. Стерилизация морковных дисков 34
2.13. Приготовление MS-среды 36
2.14. Агробактериальная трансформация дисков корнеплодов морков.. 38
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 40
3.1. ПЦР-анализ ДНК бактерий 40
3.2. Получение волосовидных корней из дисков моркови 41
3.3. Подбор оптимальных условий и питательной среды4. ВЫВОДЫ 43
4. ВЫВОДЫ 47
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 48
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 49
Агробактерии - род почвенных бактерий, обладающих способностью трансформировать растительные клетки Т-ДНК, расположенной на pTi/pRi- плазмиде последовательностью, содержащей набор генов, экспрессирующихся в клетках растений. Экспрессия этих генов приводит к пролиферации трансформированных клеток с последующим образованием опухолей или разрастаний корней.
Волосовидные корни образуются под действием таких штаммов как Agrobacterium rhizogenes, и, несмотря на действительно имеющий место в этом случае перенос некоторой части генетического материала агробактерий, подобные процессы вполне обыденно происходят в природе, в том числе и без участия человека, тогда как под генетической трансформацией в научных исследованиях принято понимать искусственный процесс по внедрению конкретных генов или иных фрагментов ДНК в геном другого организма, что, тоже проводится над корнями, но уже с помощью рекомбинантных штаммов Agrobacterium rhizogenes, несущих специальный бинарный вектор со вставкой.
Волосовидные корни индуцируют для получения вторичных метаболитов, белков, микроэлементов, витаминов и т.п.
Цель: Получение волосовидных корней мокрови, индуцированных при помощи штаммов К599, А4, К15834 Agrobacterium rhizogenes.
Задачи:
1. Получение культур индуцированных волосовидных корней моркови, вырабатывающих сладкий белок браззеин
2. Определение наиболее эффективного метода стерилизации дисков моркови.
3. Подбор оптимальной среды для выращивания культуры корней моркови.
4. Подбор оптимальной температуры для роста волосовидных корней моркови.
Объект исследования: волосовидные корни моркови, полученные с помощью Agrobacterium rhizogenes штамма К599, А4 и К15834.
Предмет исследования: корнеплод моркови (Daucus radix vegetabilis), Agrobacterium rhizogenes штамма К599, А4, К15834.
В результате выполнения поставленных нами задач была получена культура бородатых корней моркови, вырабатывающих сладкий белок браззеин. Наличие сладкого белка было подтверждено на вкус. Также были проведены работы по подбору оптимальных условий и питательной среды. Наиболее эффективным оказалась среда MS и выращивание культуры в темноте при 260С при относительной влажности 70%. Все задачи на данном этапе решены в полной мере. Полученные культуры корней моркови могут быть использованы в исследовательских целях для тестирования свойств и апробаций новых технических решений.
