Список сокращений и условных обозначений 4
ВВЕДЕНИЕ 5
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. Липополисахариды грамотрицательных бактерий: молекулярная
структура, химическая природа, токсичность 7
1.2. Биологические эффекты бактериальных липополисахаридов 13
1.3. Методы экстракции бактериальных липополисахаридов из
клеточных стенок бактерий 19
1.4. Методы определения бактериальных липополисахаридов 26
1.4.1. Экспериментальное выявление пирогенных субстанций в крови 27
1.4.2. ЛАЛ-тест 27
1.4.3. PyroGene™ 30
1.4.4. EndoZyme® и EndoLisa® 31
1.5. Endotoxin Activity Assay 31
1.6. Метод активированных частиц (МАЧ) Endotox 32
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 34
2.1. Объекты исследования 33
2.2. Приготовление селективных и дифференциально
диагностических питательных сред 33
2.3. Приготовление разведений культур микроорганизмов 35
2.4. Экстракция липополисахаридов из клеточных стенок
бактериальных клеток 36
2.5. Проведение ЛАЛ-теста 38
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 40
3.1. Экстракция липополисахаридов из клеточных стенок
бактериальных клеток 40
3.2. Модификация условий культивирования тестируемых
штаммов микроорганизмов 42
3.3. Сравнительный анализ содержания ЛПС у разных видов бактерий с
помощью ЛАЛ-теста 48
ВЫВОДЫ 50
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 51
ПРИЛОЖЕНИЕ
Актуальность исследования. На сегодняшний день достаточно подробно изучена структура липополисахаридов (ЛПС) грамотрицательных бактерий. В достаточном количестве исследований [6,17,18,42] раскрыто строение бактериального эндотоксина, основными структурными компонентами которого являются О-антиген, предопределяющий видовые и серологические особенности микроорганизма, олигосахаридное ядро, являющееся
высокомолекулярным соединением с характерной консервативной структурой, и бифосфорилированный липид (липид A), являющийся наиболее консервативной частью молекулы ЛПС, которая выполняет основную роль в развитии токсического эффекта [9,41,42]. Для ЛПС грамнегативной микрофлоры описан целый ряд биологических эффектов на макроорганизм, среди которых присутствуют как положительные, так и отрицательные факторы.
ЛПС как неизменные структурные компоненты клеточной стенки грамотрицательных бактерий, биологические эффекты которых реализуются в результате лизиса бактериальных клеток, известны как индукторы системных воспалительных реакций [43,44]. Иммунотропные препараты микробного происхождения, получаемые на основе ЛПС грамотрицательных бактерий, называемые сейчас также
иммуномодуляторами, получили в последнее время достаточно широкую популярность. Эти препараты обладают преимущественно
десенсибилизирующим и противовоспалительным действием, повышают как общую, так и специфическую резистентность макроорганизма, а также воздействуют на работу клеточного и гуморального иммунитета [3,11].
В связи с этим вопрос совершенствования методик получения фракций ЛПС в достаточном количестве весьма актуален и решение его необходимо в первую очередь для изучения ЛПС-обусловленных 5
биологических эффектов, а также для разработки новых подходов к иммунотерапии.
Цель исследования. Подбор оптимальных условий выделения ЛПС из культур грамотрицательных бактерий с максимально возможным выходом бактериальных ЛПС.
Задачи исследования
1. Сбор и анализ информации о биологических эффектах ЛПС и перспективах их практического применения в медицине и биологии.
2. Формирование коллекции культур для дальнейшего использования в качестве потенциальных суперпродуцентов ЛПС.
3. Выбор метода, обеспечивающего наибольший выход ЛПС.
4. Сравнительная оценка содержания ЛПС в клеточных стенках у бактерий разных видов.
5. Оценка влияния изменений условий культивирования на выход ЛПС из культур бактерий Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus.
Практическая значимость.
Разработан высокоэффективный и высокопроизводительный метод получения чистого препарата ЛПС из клеточной стенки Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus, освобожденного от большей части контаминирующих
высокомолекулярных органических соединений.
Отобраны штаммы-кандидаты для препаративного выделения ЛПС.
На основании полученных экспериментальных данных определены оптимальные условия культивирования штаммов-суперпродуцентов для препаративного выделения ЛПС.
Область применения результатов исследования.
Предложенный способ препаративного выделения ЛПС из клеточной стенки бактерий в перспективе может быть использован для получения субстанций ЛПС и/или его фракций на биотехнологических и 6
фармацевтических предприятиях для производства иммуномодулирующих препаратов.
1. Липополисахариды грамотрицательных бактерий являются биологически активными молекулами широкого спектра действия, обладающими протективной, противоопухолевой и иммуномодулирующей активностью.
2. На основании проведенного эксперимента можно заключить, что исследованные штаммы Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa могут быть рассмотрены как потенциальные суперпродуценты ЛПС.
3. Наиболее эффективным методом экстракции ЛПС
грамотрицательных бактерий представляется метод ультразвукового воздействия, который характеризуется более высокой
производительностью и возможностью освобождения препаратов ЛПС от большей части контаминирующих высокомолекулярных органических соединений, в том числе от нуклеиновых кислот.
4. Методом количественного определения содержания ЛПС в культурах бактерий с помощью ЛАЛ-теста было установлено содержание ЛПС у разных видов бактерий при культивировании в стандартных условиях: Escherichia coli - 4,57, Klebsiella pneumoniae - 4,71, Pseudomonas aeruginosa - 3,94.
5. На продукцию ЛПС можно влиять, изменяя условия культивирования микроорганизмов: добавлением в среду глюкозы, NaCl, а также продлевая время инкубации до 3 дней.
