Помощь студентам в учебе
ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ НА ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИЮ
|
Список сокращений и условных обозначений 3
ВВЕДЕНИЕ 4
Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 8
1.1. Культивирование микроорганизмов 8
1.2. Изучение процессов свободно-радикального окисления 12
1.3. Хемилюминесцентный метод исследования свободно¬радикального окисления 20
1.4. Изучение процессов окислительного стресса в культивировании
микроорганизмов 24
1.5. Окислительный стресс у бактерий о повреждения молекуляр-ных структур активными формами кислорода 27
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 36
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 42
3.1. Культивирование микроорганизмов на питательных средах. .. 42
3.2. Изучение процессов хемилюминесценции сред культивирования
микроорганизмов 45
3.3. Влияние исследуемых сред на параметры хемилюминесценции
в динамике 46
3.4. Исследование процессов СРО в средах с культивированным в
них микрорганизмом 48
3.5. Исследование влияния стресс-фактора NaCl на изменения
параметров ХЛ (светосумма) 73
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 63
ВЫВОДЫ 68
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 68
ПРИЛОЖЕНИЕ 77
ВВЕДЕНИЕ 4
Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 8
1.1. Культивирование микроорганизмов 8
1.2. Изучение процессов свободно-радикального окисления 12
1.3. Хемилюминесцентный метод исследования свободно¬радикального окисления 20
1.4. Изучение процессов окислительного стресса в культивировании
микроорганизмов 24
1.5. Окислительный стресс у бактерий о повреждения молекуляр-ных структур активными формами кислорода 27
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 36
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 42
3.1. Культивирование микроорганизмов на питательных средах. .. 42
3.2. Изучение процессов хемилюминесценции сред культивирования
микроорганизмов 45
3.3. Влияние исследуемых сред на параметры хемилюминесценции
в динамике 46
3.4. Исследование процессов СРО в средах с культивированным в
них микрорганизмом 48
3.5. Исследование влияния стресс-фактора NaCl на изменения
параметров ХЛ (светосумма) 73
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 63
ВЫВОДЫ 68
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 68
ПРИЛОЖЕНИЕ 77
ЭКДА - экстракт кормовых дрожжей агаризованный
ВВЕДЕНИЕ
Современная микробиология без питательных сред существовать не может, а их качество во многом определяет информативность и точность микробиологического анализа [13]. Питательные среды по праву можно назвать основой микробиологии. Они используются в диагностике инфекционных заболеваний и при эпидемиологическом контроле за санитарным состоянием окружающей среды, в производстве вакцинных и биологически активных препаратов, при выборе рациональной антибиотикотерапии и контроле за качеством лечения, при определении микробной загрязненности лекарственных препаратов и проведении лабораторных исследований с музейными и свежевыделенными штаммами микроорганизмов. Гарантией получения достоверных результатов микробиологических исследований является использование питательных сред стабильно высокого качества, которое может быть достигнуто при промышленном производстве, где в основе коммерческих разработок лежат научные разработки, где налажен процесс контроля качества, в процессе которого тщательно проверяется качество сырья и конечного продукта [12]. При подборе питательной среды, следует учитывать ее полноценность, то есть обоснованный и сбалансированный набор различных питательных соединений, необходимых микроорганизму для построения растущей клетки. Для нормального роста и развития микроорганизмов в питательной среде должны присутствовать все элементы, из которых формируется клетка [41]. Бактерии нередко оказываются под действием факторов и условий, способных вызвать окисление компонентов клеток. Основными прооксидантами являются ионизирующее излучение и свободные радикалы, которые в аэробных условиях представлены, в основном, активными формами кислорода (АФК). Свободные радикалы участвуют в поддержании гомеостаза аэробных организмов, аккумуляции и биотрансформации энергии, обеспечивают защитные функции, в частности, детоксикацию чужеродных соединений, влияют на иммунитет [46]. Активность возникновения свободных радикалов находится в прямой зависимости и от состояния окружающей среды [27]. Отсутствие баланса между продукцией активных форм кислорода (АФК) и активностью антиоксидантной защиты живых клеток является одной из главных причин возникновения многих заболеваний на молекулярно-клеточном уровне. Чрезмерное количество АФК в клетке приводит к повреждению ДНК, белков и клеточных мембран и как следствие, повреждению клеток организма [45]. Эти радикалы особенно активно взаимодействуют с мембранными липидами, содержащими ненасыщенные связи, и изменяют свойства клеточных мембран [25]. Перекисное окисление липидов, индикатор окислительного стресса в клетках и тканях, считается довольно хорошо выученным механизмом повреждения [57]. Поскольку процесс перекисного окисления липидов сопровождается хемилюминесценцией (ХЛ), весьма перспективными являются хемилюминесцентные методики, которые характеризуются высокой чувствительностью, простотой и дешевизной [10]. Непрерывный мониторинг активных форм кислорода (АФК) в биологических системах - одна из нерешенных проблем в связи с их высокой реакционной способностью и коротким сроком жизни. Более того, изучение кинетических характеристик АФК является крайне сложным из-за множества взаимосвязанных друг с другом окислительно - восстановительных реакций и низких концентраций АФК, динамично меняющихся с течением времени [39]. Поскольку окислительный стресс является нарушением баланса между системой генерации АФК и системой антиоксидантной защиты, то при его оценке требуется количественное описание обеих составляющих. Для этих целей может быть успешно использован хемилюминесцентный метод анализа [5]. Метод хемилюминесцентного анализа является одним из наиболее информативных методов и позволяет с большой точностью определить интенсивность протекания свободно-радикальных реакций в биологических системах, а также оценить эффективность работы систем антиоксидантной защиты организма и АОА фармакологических веществ [15]. Хемилюминесцентные методы обладают высокой чувствительностью и позволяют проводить кинетические измерения [49]. Исследователи имеют крайне ограниченные возможности управления хемилюминесцентными реакциями - практически только смешение реагентов и изменение температуры. Это препятствует созданию новых хемилюминесцентных диагностических систем с заданными свойствами, например, обладающих избирательностью действия. Таким образом разработка новых хемилюминесцентных диагностических систем является актуальной задачей [18].
Цель исследования: Изучить влияние условий культивирования бактерий на хемилюминесценцию.
Задачи исследования.
1. Изучить показатели хемилюминесценции в условиях культивирования микроорганизмов на разных питательных средах.
2. Выяснить, как меняются параметры хемилюминесценции в динамике культивирования микроорганизмов.
3. Изучить влияние стресс-фактора NaCl на параметры хемилюминесценции, как условия культивирования.
4. Охарактеризовать практическое применение хемилюминесцентного метода для оценки условий культивирования и изучения функциональнометаболической активности микроорганизмов.
Научная новизна:
1. Впервые было изучено изменение хемилюминесценции питательных сред в динамике культивирования: проведена оценка действия фактора времени на параметры хемилюминесценции;
2. Впервые была дана оценка на параметры хемилюминесценции различных питательных сред, как условий культивирования, связанных с разным качественно-количественным составом элементов питания;
3. Впервые было изучено действие на параметры хемилюминесценции водного раствора NaOl для создания в среде культивирования микроорганизмов условий окислительного стресса.
План работы:
1. Изучение процессов хемилюминесценции сред культивирования микроорганизмов.
2. Исследование влияния изменения условий культивирования микроорганизмов (разные питательные среды, динамика культивирования, добавление стресс-фактора водного раствора NaQ) на параметры хемилюминесценции.
3. Анализ и оценка полученных данных параметров ХЛ (светосумма).
ВВЕДЕНИЕ
Современная микробиология без питательных сред существовать не может, а их качество во многом определяет информативность и точность микробиологического анализа [13]. Питательные среды по праву можно назвать основой микробиологии. Они используются в диагностике инфекционных заболеваний и при эпидемиологическом контроле за санитарным состоянием окружающей среды, в производстве вакцинных и биологически активных препаратов, при выборе рациональной антибиотикотерапии и контроле за качеством лечения, при определении микробной загрязненности лекарственных препаратов и проведении лабораторных исследований с музейными и свежевыделенными штаммами микроорганизмов. Гарантией получения достоверных результатов микробиологических исследований является использование питательных сред стабильно высокого качества, которое может быть достигнуто при промышленном производстве, где в основе коммерческих разработок лежат научные разработки, где налажен процесс контроля качества, в процессе которого тщательно проверяется качество сырья и конечного продукта [12]. При подборе питательной среды, следует учитывать ее полноценность, то есть обоснованный и сбалансированный набор различных питательных соединений, необходимых микроорганизму для построения растущей клетки. Для нормального роста и развития микроорганизмов в питательной среде должны присутствовать все элементы, из которых формируется клетка [41]. Бактерии нередко оказываются под действием факторов и условий, способных вызвать окисление компонентов клеток. Основными прооксидантами являются ионизирующее излучение и свободные радикалы, которые в аэробных условиях представлены, в основном, активными формами кислорода (АФК). Свободные радикалы участвуют в поддержании гомеостаза аэробных организмов, аккумуляции и биотрансформации энергии, обеспечивают защитные функции, в частности, детоксикацию чужеродных соединений, влияют на иммунитет [46]. Активность возникновения свободных радикалов находится в прямой зависимости и от состояния окружающей среды [27]. Отсутствие баланса между продукцией активных форм кислорода (АФК) и активностью антиоксидантной защиты живых клеток является одной из главных причин возникновения многих заболеваний на молекулярно-клеточном уровне. Чрезмерное количество АФК в клетке приводит к повреждению ДНК, белков и клеточных мембран и как следствие, повреждению клеток организма [45]. Эти радикалы особенно активно взаимодействуют с мембранными липидами, содержащими ненасыщенные связи, и изменяют свойства клеточных мембран [25]. Перекисное окисление липидов, индикатор окислительного стресса в клетках и тканях, считается довольно хорошо выученным механизмом повреждения [57]. Поскольку процесс перекисного окисления липидов сопровождается хемилюминесценцией (ХЛ), весьма перспективными являются хемилюминесцентные методики, которые характеризуются высокой чувствительностью, простотой и дешевизной [10]. Непрерывный мониторинг активных форм кислорода (АФК) в биологических системах - одна из нерешенных проблем в связи с их высокой реакционной способностью и коротким сроком жизни. Более того, изучение кинетических характеристик АФК является крайне сложным из-за множества взаимосвязанных друг с другом окислительно - восстановительных реакций и низких концентраций АФК, динамично меняющихся с течением времени [39]. Поскольку окислительный стресс является нарушением баланса между системой генерации АФК и системой антиоксидантной защиты, то при его оценке требуется количественное описание обеих составляющих. Для этих целей может быть успешно использован хемилюминесцентный метод анализа [5]. Метод хемилюминесцентного анализа является одним из наиболее информативных методов и позволяет с большой точностью определить интенсивность протекания свободно-радикальных реакций в биологических системах, а также оценить эффективность работы систем антиоксидантной защиты организма и АОА фармакологических веществ [15]. Хемилюминесцентные методы обладают высокой чувствительностью и позволяют проводить кинетические измерения [49]. Исследователи имеют крайне ограниченные возможности управления хемилюминесцентными реакциями - практически только смешение реагентов и изменение температуры. Это препятствует созданию новых хемилюминесцентных диагностических систем с заданными свойствами, например, обладающих избирательностью действия. Таким образом разработка новых хемилюминесцентных диагностических систем является актуальной задачей [18].
Цель исследования: Изучить влияние условий культивирования бактерий на хемилюминесценцию.
Задачи исследования.
1. Изучить показатели хемилюминесценции в условиях культивирования микроорганизмов на разных питательных средах.
2. Выяснить, как меняются параметры хемилюминесценции в динамике культивирования микроорганизмов.
3. Изучить влияние стресс-фактора NaCl на параметры хемилюминесценции, как условия культивирования.
4. Охарактеризовать практическое применение хемилюминесцентного метода для оценки условий культивирования и изучения функциональнометаболической активности микроорганизмов.
Научная новизна:
1. Впервые было изучено изменение хемилюминесценции питательных сред в динамике культивирования: проведена оценка действия фактора времени на параметры хемилюминесценции;
2. Впервые была дана оценка на параметры хемилюминесценции различных питательных сред, как условий культивирования, связанных с разным качественно-количественным составом элементов питания;
3. Впервые было изучено действие на параметры хемилюминесценции водного раствора NaOl для создания в среде культивирования микроорганизмов условий окислительного стресса.
План работы:
1. Изучение процессов хемилюминесценции сред культивирования микроорганизмов.
2. Исследование влияния изменения условий культивирования микроорганизмов (разные питательные среды, динамика культивирования, добавление стресс-фактора водного раствора NaQ) на параметры хемилюминесценции.
3. Анализ и оценка полученных данных параметров ХЛ (светосумма).
При выполнении данной выпускной квалификационной работы были изучены теоретические основы темы исследования - метод хемилюминесценции, микробиологические методы, подобраны питательные среды, материалы для исследования, а также проанализированы научные публикации по теме работы, осуществлялся подбор современных в том числе иностранных источников для обзора литературы.
В данной работе была предпринята попытка оценить влияние условий культивирования микроорганизмов на хемилюминесценцию питательных сред, которая отражает процессы свободно-радикального окисления. Свободно-радикальное окисление, протекающее с образованием высокореакционных соединений - свободных радикалов (СР), в первую очередь активных форм кислорода (АФК), является жизненно-важным процессом. Содержание свободных радикалов в окружающей среде способно влиять на процессы роста и развития самих микроорганизмов. Извeстнo, что продукты окисления тормозят клеточное деление, в то время как, повышение антиоксидантной активности стимулирует размножение клеток.
Необходимость проведения подобного исследования обуславливалось следующими задачами:
1. Оценить характер действия различных питательных сред и сред, с культивируемым в них микроорганизмом на образование радикалов кислорода;
2. Изучить изменения хемилюминесценции в динамике питательных сред на генерацию активных форм кислорода;
3. Оценить характер действия стресс-фактора, при добавлении его в питательные среды, на параметры хемилюминесценции.
Таким образом, качественно-количественный состав среды, время инкубации и действие стресс-фактора являлись условиями, влияние которых оценивалось на показатели хемилюминесценции.
В модельной системе образование АФК инициировали добавлением железа. Об интенсивности образования радикалов судили по сопровождающей процессы окисления хемилюминесценции. При добавлении исследуемых образцов в модельные системы интенсивность хемилюминесценции менялась, что отражало их влияние на процессы образования активных форм кислорода.
Таким образом, результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что условия культивирования приводят к сдвигам параметров хемилюминесценции.
Культуральные среды и среды с культивируемым в них МО, влияют на процессы свободно-радикального окисления. Среды, широко используемые для культивирования микроорганизмов, по-разному влияют на интенсивность хемилюминесценции в модельной системе, генерирующей радикалы кислорода. Полученные данные могут быть использованы при конструировании новых питательных сред для направленного изменения процессов свободно-радикального окисления, что может сказаться на интенсивности размножения микроорганизмов.
По результатам нашей работы выбранный в качестве фактора стресса водный раствор NaCl не вызвал никаких достоверных изменений. Исследование показало, что в течение времени изменяются показатели хемилюминесценции питательных сред и сред с культивируемыми в них микроорганизмом. Таким образом, качественно-количественный состав питательных средств и время как условия культивирования приводят к изменению хемилюминесценции .
Проведенные исследования создают предпосылки для практического применения разработанных в данной работе методик, а именно изменения показателей свечения позволят оценить условия культивирования микроорганизмов с их последующей коррекцией. Полученные данные дают возможность разработать экспресс-методы оценки функциональной активности микроорганизмов и параметров среды, в которой происходит их рост и развитие.
В данной работе была предпринята попытка оценить влияние условий культивирования микроорганизмов на хемилюминесценцию питательных сред, которая отражает процессы свободно-радикального окисления. Свободно-радикальное окисление, протекающее с образованием высокореакционных соединений - свободных радикалов (СР), в первую очередь активных форм кислорода (АФК), является жизненно-важным процессом. Содержание свободных радикалов в окружающей среде способно влиять на процессы роста и развития самих микроорганизмов. Извeстнo, что продукты окисления тормозят клеточное деление, в то время как, повышение антиоксидантной активности стимулирует размножение клеток.
Необходимость проведения подобного исследования обуславливалось следующими задачами:
1. Оценить характер действия различных питательных сред и сред, с культивируемым в них микроорганизмом на образование радикалов кислорода;
2. Изучить изменения хемилюминесценции в динамике питательных сред на генерацию активных форм кислорода;
3. Оценить характер действия стресс-фактора, при добавлении его в питательные среды, на параметры хемилюминесценции.
Таким образом, качественно-количественный состав среды, время инкубации и действие стресс-фактора являлись условиями, влияние которых оценивалось на показатели хемилюминесценции.
В модельной системе образование АФК инициировали добавлением железа. Об интенсивности образования радикалов судили по сопровождающей процессы окисления хемилюминесценции. При добавлении исследуемых образцов в модельные системы интенсивность хемилюминесценции менялась, что отражало их влияние на процессы образования активных форм кислорода.
Таким образом, результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что условия культивирования приводят к сдвигам параметров хемилюминесценции.
Культуральные среды и среды с культивируемым в них МО, влияют на процессы свободно-радикального окисления. Среды, широко используемые для культивирования микроорганизмов, по-разному влияют на интенсивность хемилюминесценции в модельной системе, генерирующей радикалы кислорода. Полученные данные могут быть использованы при конструировании новых питательных сред для направленного изменения процессов свободно-радикального окисления, что может сказаться на интенсивности размножения микроорганизмов.
По результатам нашей работы выбранный в качестве фактора стресса водный раствор NaCl не вызвал никаких достоверных изменений. Исследование показало, что в течение времени изменяются показатели хемилюминесценции питательных сред и сред с культивируемыми в них микроорганизмом. Таким образом, качественно-количественный состав питательных средств и время как условия культивирования приводят к изменению хемилюминесценции .
Проведенные исследования создают предпосылки для практического применения разработанных в данной работе методик, а именно изменения показателей свечения позволят оценить условия культивирования микроорганизмов с их последующей коррекцией. Полученные данные дают возможность разработать экспресс-методы оценки функциональной активности микроорганизмов и параметров среды, в которой происходит их рост и развитие.
