Особенности хемилюминесценции питательных сред в процессе культивирования бактерий различных видов
|
Список сокращений и условных обозначений 3
ВВЕДЕНИЕ 4
Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 8
1.1. Процессы культивирования микроорганизмов 8
1.2. Оксидативные процессы и окислительный стресс 12
1.3. Регистрация хемилюминесценции как метод исследования оксидативных
процессов 14
1.4. Оксидативные процессы и окислительный стресс при культивировании
микроорганизмов 18
1.5. Роль оксидативного стресса в повреждении молекулярных структур
микроорганизмов 23
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 28
2.1 Этапы исследования 28
2.2. Методы исследования 30
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 32
3.1. Исследование антиокислительной активности ГРМ-бульона по данным
регистрации хемилюминесценции 32
3.2. Исследование спонтанной антиокислительной активности сред, при
культивировании бактерий различных видов по данным регистрации хемилюминесценции 33
3.3. Исследование индуцированной антиокислительной активности сред, при культивировании бактерий различных видов по данным хемилюминесценции 36
3.4. Исследование антиокислительного потенциала сред, при
культивировании бактерий различных видов по данным хемилюминесценции 38
3АКЛЮЧЕНИЕ 41
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 45
ПРИЛОЖЕНИЕ 75
ВВЕДЕНИЕ 4
Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 8
1.1. Процессы культивирования микроорганизмов 8
1.2. Оксидативные процессы и окислительный стресс 12
1.3. Регистрация хемилюминесценции как метод исследования оксидативных
процессов 14
1.4. Оксидативные процессы и окислительный стресс при культивировании
микроорганизмов 18
1.5. Роль оксидативного стресса в повреждении молекулярных структур
микроорганизмов 23
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 28
2.1 Этапы исследования 28
2.2. Методы исследования 30
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 32
3.1. Исследование антиокислительной активности ГРМ-бульона по данным
регистрации хемилюминесценции 32
3.2. Исследование спонтанной антиокислительной активности сред, при
культивировании бактерий различных видов по данным регистрации хемилюминесценции 33
3.3. Исследование индуцированной антиокислительной активности сред, при культивировании бактерий различных видов по данным хемилюминесценции 36
3.4. Исследование антиокислительного потенциала сред, при
культивировании бактерий различных видов по данным хемилюминесценции 38
3АКЛЮЧЕНИЕ 41
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 45
ПРИЛОЖЕНИЕ 75
Актуальность исследования. Для поддержания жизнедеятельности микроорганизмов, их нормального роста и развития требуются соответствующие условия. При культивировании важнейшие элементы питания и факторы роста поступают в бактериальную клетку в составе питательных сред (ПС). ПС имеют важное значение для постановки экспериментов в различных областях научного знания о микроорганизмах, а также служат необходимым средством для решения клинических задач; они находят применение в клинической и лабораторной диагностике, в микробиологии, биотехнологии, клеточных технологиях, биоинженерии при выращивании тканей [45]. Очевидно, что при культивировании
микроорганизмов питательные среды играют роль окружения для микробной клетки, которое не является стабильным, а меняется в ходе развития микроорганизмов. Хорошо известно, что истощение элементов питания выступает естественным ограничивающим фактором роста, а применение специальных сред позволяет селективно получать культуры необходимых микроорганизмов. Состояние питательной среды отражает характеристики метаболизма бактерий, а наличие в средах определенных продуктов может свидетельствовать о соответствующей фазе развития бактерий. Поскольку параметры питательных сред изменяются, то они могут рассматриваться в качестве индикатора функционально-метаболического состояния клетки.
Одним из параметров состояния питательных сред является их антиокислительная активность - способность противодействовать образованию свободных радикалов: активных форм кислорода (АФК) и пероксидных липидных радикалов [11]. Чрезмерное образование свободных радикалов лежит в основе феномена окислительного стресса [10,11]. Окислительный стресс является универсальным звеном повреждения молекул и структур клеток, и кроме того, он является причиной апоптоза и некроза. Снижение антиокислительной активности в среде культивирования может свидетельствовать о развитии в ней окислительного стресса, снижении активности защитных ферментных систем клеток, активной выработки окислительных метаболитов.
Среди методов определения антиокислительной активности субстратов, одним из наиболее чувствительных является метод регистрации хемилюминесценции. Хемилюминесценция (ХЛ) - это свечение, которое возникает при взаимодействии свободных радикалов, которое может быть избирательно усилено при добавлении различных веществ, в частности, люциногена и люминола [10, 57].
Разные микроорганизмы характеризуются особенностями метаболизма и отличаются по способности к сопротивлению процессам окислительного стресса. Изменение антиокислительной активности сред при культивировании микроорганизмов отражает их способность противодействовать образованию свободных радикалов. Поэтому изучение антиокислительной активности сред позволит охарактеризовать функционально-метаболические особенности бактерий различных видов, активность ферменных систем по утилизации свободных радикалов.
В прикладном плане, применение хемилюминесцентных методов позволит разработать экспресс-методы определения функционального состояния микроорганизмов, их способности сопротивляться свободно-радикальным процессам, контролировать условия их роста и может явиться одним из оснований для создания новых питательных сред. Сказанным и предопределен выбор темы магистерской диссертации.
Цель исследования: оценка особенностей хемилюминесценции питательных сред при культивировании бактерий различных видов для выявления их способности противодействовать образованию свободно-радикальных агентов.
Задачи исследования.
1) Исследовать антиокислительную активность ГРМ-бульона как среды культивирования бактерий в качестве контроля исследования по данным регистрации ХЛ.
2) Определить спонтанную антиокислительную активность сред при культивировании бактерий разных видов по данным ХЛ
3) Оценить активированную антиокислительную активность сред при культивировании бактерий разных видов в условиях оксидативного стресса по данным ХЛ
4) Исследовать антиокислительный потенциал сред при культивировании бактерий различных видов, как показатель, отражающий степень снижения антиокислительной активности при воздействии индуктора по данным ХЛ.
5) Оценить интегральную способность бактерий различных видов противодействовать образованию свободно-радикальных агентов, определяемых методом ХЛ посредством сравнения самых низких значений антиокислительной активности сред культивирования одного из видов бактерий, с самыми высокими значениями антиокислительной активности среды культивирования другого вида бактерии.
Научная новизна диссертационного исследования заключается в том, что впервые будет изучен как базальный (спонтанный) уровень хемилюминесценции питательных сред в динамике культивирования микроорганизмов различных видов, отражающий спонтанные оксидативные процессы так и индуцированный уровень хемилюминесценции питательных сред, при моделировании оксидативного стресса в среде культивирования. Будет дана сравнительная оценка бактерий различных видов противодействовать образованию свободных радикалов.
Теоретическая значимость диссертационного исследования заключается в выявлении особенностей метаболизма микроорганизмов, отвечающих за сопротивляемость к антибактериальным факторам: способность противодействовать образованию может лежать в основе устойчивости микроорганизмов. Разные уровни сопротивляемости к оксидативным процессам могут обусловливать разные способности бактерий сохранять свою жизнеспособность в условиях повреждающего воздействия.
Научно практическое значение диссертационного исследования заключается в разработке основанных на регистрации хемилюминесценции экспресс-методов определения функционально-метаболического состояния микроорганизмов, отражающего их антиоксидантные способности.
микроорганизмов питательные среды играют роль окружения для микробной клетки, которое не является стабильным, а меняется в ходе развития микроорганизмов. Хорошо известно, что истощение элементов питания выступает естественным ограничивающим фактором роста, а применение специальных сред позволяет селективно получать культуры необходимых микроорганизмов. Состояние питательной среды отражает характеристики метаболизма бактерий, а наличие в средах определенных продуктов может свидетельствовать о соответствующей фазе развития бактерий. Поскольку параметры питательных сред изменяются, то они могут рассматриваться в качестве индикатора функционально-метаболического состояния клетки.
Одним из параметров состояния питательных сред является их антиокислительная активность - способность противодействовать образованию свободных радикалов: активных форм кислорода (АФК) и пероксидных липидных радикалов [11]. Чрезмерное образование свободных радикалов лежит в основе феномена окислительного стресса [10,11]. Окислительный стресс является универсальным звеном повреждения молекул и структур клеток, и кроме того, он является причиной апоптоза и некроза. Снижение антиокислительной активности в среде культивирования может свидетельствовать о развитии в ней окислительного стресса, снижении активности защитных ферментных систем клеток, активной выработки окислительных метаболитов.
Среди методов определения антиокислительной активности субстратов, одним из наиболее чувствительных является метод регистрации хемилюминесценции. Хемилюминесценция (ХЛ) - это свечение, которое возникает при взаимодействии свободных радикалов, которое может быть избирательно усилено при добавлении различных веществ, в частности, люциногена и люминола [10, 57].
Разные микроорганизмы характеризуются особенностями метаболизма и отличаются по способности к сопротивлению процессам окислительного стресса. Изменение антиокислительной активности сред при культивировании микроорганизмов отражает их способность противодействовать образованию свободных радикалов. Поэтому изучение антиокислительной активности сред позволит охарактеризовать функционально-метаболические особенности бактерий различных видов, активность ферменных систем по утилизации свободных радикалов.
В прикладном плане, применение хемилюминесцентных методов позволит разработать экспресс-методы определения функционального состояния микроорганизмов, их способности сопротивляться свободно-радикальным процессам, контролировать условия их роста и может явиться одним из оснований для создания новых питательных сред. Сказанным и предопределен выбор темы магистерской диссертации.
Цель исследования: оценка особенностей хемилюминесценции питательных сред при культивировании бактерий различных видов для выявления их способности противодействовать образованию свободно-радикальных агентов.
Задачи исследования.
1) Исследовать антиокислительную активность ГРМ-бульона как среды культивирования бактерий в качестве контроля исследования по данным регистрации ХЛ.
2) Определить спонтанную антиокислительную активность сред при культивировании бактерий разных видов по данным ХЛ
3) Оценить активированную антиокислительную активность сред при культивировании бактерий разных видов в условиях оксидативного стресса по данным ХЛ
4) Исследовать антиокислительный потенциал сред при культивировании бактерий различных видов, как показатель, отражающий степень снижения антиокислительной активности при воздействии индуктора по данным ХЛ.
5) Оценить интегральную способность бактерий различных видов противодействовать образованию свободно-радикальных агентов, определяемых методом ХЛ посредством сравнения самых низких значений антиокислительной активности сред культивирования одного из видов бактерий, с самыми высокими значениями антиокислительной активности среды культивирования другого вида бактерии.
Научная новизна диссертационного исследования заключается в том, что впервые будет изучен как базальный (спонтанный) уровень хемилюминесценции питательных сред в динамике культивирования микроорганизмов различных видов, отражающий спонтанные оксидативные процессы так и индуцированный уровень хемилюминесценции питательных сред, при моделировании оксидативного стресса в среде культивирования. Будет дана сравнительная оценка бактерий различных видов противодействовать образованию свободных радикалов.
Теоретическая значимость диссертационного исследования заключается в выявлении особенностей метаболизма микроорганизмов, отвечающих за сопротивляемость к антибактериальным факторам: способность противодействовать образованию может лежать в основе устойчивости микроорганизмов. Разные уровни сопротивляемости к оксидативным процессам могут обусловливать разные способности бактерий сохранять свою жизнеспособность в условиях повреждающего воздействия.
Научно практическое значение диссертационного исследования заключается в разработке основанных на регистрации хемилюминесценции экспресс-методов определения функционально-метаболического состояния микроорганизмов, отражающего их антиоксидантные способности.
При выполнении магистерской диссертации были изучены фундаментальные аспекты микробиологии и биофизики и освоены отдельные методы: метод регистрации хемилюминесценции, оценка
спонтанной (базальной) и индуцированной антиокислительной активности сред при культивировании бактерий различных видов, проанализированы источники литературы по теме работы, в первую очередь для обзора литературы.
В данной работе была предпринята попытка оценить хемилюминесценцию сред при культивировании бактерий различных видов, для выявления их способности противодействовать образованию свободных радикалов. Регистрация ХЛ позволила оценить антиокислительную активность при культивировании микроорганизмов, отражающую потенциал микроорганизма купировать оксидативные процессы. Исследование проводилось в модельных системах, в которых инициировалось образование одних их наиболее реакционно-способных свободных радикалов - активных форм кислорода (АФК). АФК первыми возникают в свободнорадикальных реакциях и инициируют последующее развитие цепей окисления. Добавление образов среды культивирования в модельную систему позволило оценить особенности метаболизма бактерий различных видов. Для проведения данной оценки в магистерской диссертации были поставлены следующие задачи:
1) Исследование антиокислительной активности ГРМ-бульона как среды культивирования бактерий в качестве контроля исследования по данным регистрации ХЛ
2) Определение спонтанной антиокислительной активности сред при культивировании бактерий разных видов по данным ХЛ
3) Сравнительная оценка активированной антиокислительной активности сред при культивировании бактерий разных видов в условиях оксидативного стресса по данным ХЛ.
4) Исследование антиокислительного потенциала сред при культивировании бактерий различных видов, как показателя, отражающего степень снижения антиокислительной активности при воздействии индуктора по данным ХЛ.
5) Сравнение самых низких значений антиокислительной активности сред одного из микроорганизмов, с самыми высокими значениями антиокислительной активности сред другого микроорганизма, для оценки их интегральной способности противодействовать образованию свободно-радикальных агентов, определяемых методом ХЛ.
Образцы сред с бактериями обладали антиокислительной активностью. Однако, на первые сутки уровень антиокислительной активности сред соответствовал уровню контроля. Увеличение антиокислительной активности отмечалась на пятые сутки, на седьмые сутки данное увеличение становилось более выраженным. Данная динамика была характерна как для спонтанных (базальных), так и активированных индуктором NaCl оксидативных процессов.
Сравнительный анализ бактерий различных видов показал, что антиокислительная активность образцов сред с Pseudomonas aeruginosa имела более выраженный характер, чем в образцах сред с Escherichia coli. Установленная тенденция затрагивала среды, как с индуктором, так и без индуктора оксидативных процессов.
Для оценки сохранять микроорганизмом антиокислительную активность среды был проанализирован так называемый антиокислительный потенциал, определяемый как разница между спонтанными и индуцированными параметрами ХЛ. Было установлено, что Escherichia coli лучше сохраняет антиокислительную активность, однако показатель антиокислительного потенциала отражает сравнение характеристик одного и того же микроорганизма. Поэтому, далее производилось сравнение самых низких значений антиокислительной активности сред одного из микроорганизмов, с самыми высокими значениями антиокислительной активности сред другого микроорганизма. Было показано, что параметры ХЛ сред Pseudomonas aeruginosa с самой сильной индукцией NaCL не достигали спонтанных значений ХЛ сред с Escherichia coli. То есть в любом случае, антиокислительная активность сред с Pseudomonas aeruginosa была выше, чем у Escherichia coli. Это подтверждает лучшую способность Pseudomonas aeruginosa противодействовать образованию свободно-радикальных агентов.
Проведенные исследования создают предпосылки для практического применения используемых в данной работе методик, а именно разработки основанных на регистрации хемилюминесценции экспресс-методов определения функционально-метаболического состояния бактерий различных видов, отражающего их антиоксидантные способности.
спонтанной (базальной) и индуцированной антиокислительной активности сред при культивировании бактерий различных видов, проанализированы источники литературы по теме работы, в первую очередь для обзора литературы.
В данной работе была предпринята попытка оценить хемилюминесценцию сред при культивировании бактерий различных видов, для выявления их способности противодействовать образованию свободных радикалов. Регистрация ХЛ позволила оценить антиокислительную активность при культивировании микроорганизмов, отражающую потенциал микроорганизма купировать оксидативные процессы. Исследование проводилось в модельных системах, в которых инициировалось образование одних их наиболее реакционно-способных свободных радикалов - активных форм кислорода (АФК). АФК первыми возникают в свободнорадикальных реакциях и инициируют последующее развитие цепей окисления. Добавление образов среды культивирования в модельную систему позволило оценить особенности метаболизма бактерий различных видов. Для проведения данной оценки в магистерской диссертации были поставлены следующие задачи:
1) Исследование антиокислительной активности ГРМ-бульона как среды культивирования бактерий в качестве контроля исследования по данным регистрации ХЛ
2) Определение спонтанной антиокислительной активности сред при культивировании бактерий разных видов по данным ХЛ
3) Сравнительная оценка активированной антиокислительной активности сред при культивировании бактерий разных видов в условиях оксидативного стресса по данным ХЛ.
4) Исследование антиокислительного потенциала сред при культивировании бактерий различных видов, как показателя, отражающего степень снижения антиокислительной активности при воздействии индуктора по данным ХЛ.
5) Сравнение самых низких значений антиокислительной активности сред одного из микроорганизмов, с самыми высокими значениями антиокислительной активности сред другого микроорганизма, для оценки их интегральной способности противодействовать образованию свободно-радикальных агентов, определяемых методом ХЛ.
Образцы сред с бактериями обладали антиокислительной активностью. Однако, на первые сутки уровень антиокислительной активности сред соответствовал уровню контроля. Увеличение антиокислительной активности отмечалась на пятые сутки, на седьмые сутки данное увеличение становилось более выраженным. Данная динамика была характерна как для спонтанных (базальных), так и активированных индуктором NaCl оксидативных процессов.
Сравнительный анализ бактерий различных видов показал, что антиокислительная активность образцов сред с Pseudomonas aeruginosa имела более выраженный характер, чем в образцах сред с Escherichia coli. Установленная тенденция затрагивала среды, как с индуктором, так и без индуктора оксидативных процессов.
Для оценки сохранять микроорганизмом антиокислительную активность среды был проанализирован так называемый антиокислительный потенциал, определяемый как разница между спонтанными и индуцированными параметрами ХЛ. Было установлено, что Escherichia coli лучше сохраняет антиокислительную активность, однако показатель антиокислительного потенциала отражает сравнение характеристик одного и того же микроорганизма. Поэтому, далее производилось сравнение самых низких значений антиокислительной активности сред одного из микроорганизмов, с самыми высокими значениями антиокислительной активности сред другого микроорганизма. Было показано, что параметры ХЛ сред Pseudomonas aeruginosa с самой сильной индукцией NaCL не достигали спонтанных значений ХЛ сред с Escherichia coli. То есть в любом случае, антиокислительная активность сред с Pseudomonas aeruginosa была выше, чем у Escherichia coli. Это подтверждает лучшую способность Pseudomonas aeruginosa противодействовать образованию свободно-радикальных агентов.
Проведенные исследования создают предпосылки для практического применения используемых в данной работе методик, а именно разработки основанных на регистрации хемилюминесценции экспресс-методов определения функционально-метаболического состояния бактерий различных видов, отражающего их антиоксидантные способности.
Подобные работы
- Исследование прооксидантной активности противогрибковых препаратов методом регистрации хемилюминесценции
Дипломные работы, ВКР, биология. Язык работы: Русский. Цена: 4500 р. Год сдачи: 2023