Список сокращений и условных обозначений 3
ВВЕДЕНИЕ 4
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1. Химическая природа и молекулярная структура липополисахаридов 7
1.1.1. О-полисахаридная цепь 8
1.1.2. Олигосахаридный кор 10
1.1.3. Липид А 12
1.2. Негативные эффекты липополисахаридов 13
1.3. Иммуностимулирующие эффекты липополисахаридов 15
1.4. Методы выделения липополисахаридов из клеточных стенок
бактерий 17
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 23
2.1. Объекты исследования 23
2.2. Приготовление селективных и дифференциально
диагностических питательных сред 23
2.3. Посев музейной культуры Escherichia coli на жидкую
питательную среду 24
2.4. Условия культивирования микроорганизмов 25
2.5. Центрифугирование жидкой культуры для получения
микробной массы 25
2.6. Приготовление рабочих растворов 26
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 27
3.1. Экстракция липополисахаридов из клеточных стенок
бактериальных клеток 27
3.2. Выделение липополисахаридов с помощью колоночной
хроматографии 32
3.2. Подтверждение состава липополисахаридов 33
ВЫВОДЫ 36
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 37
Актуальность исследования. На сегодняшний день проблемы инфекционной патологии не потеряли своей актуальности, поскольку до сих пор являются причиной трети общего ежегодного количества смертей в мире. Прогрессирующий рост числа инфекционных заболеваний, возбудителями которых являются условно-патогенные грамотрицательные бактерии (ГОБ) из семейства Enterobacteriaceae, также не имеет положительных тенденций, потому что в настоящее время большинство клинических штаммов ГОБ являются мультирезистентными и, как следствие, вызванные ими нозокомиальные инфекции плохо поддаются лечению (Бондаренко, 2007; Варбанец 2002). Стоит отметить, что ГОБ все также принадлежит ведущая роль в развитии гнойно-септической инфекции, причем из года в год наблюдается устойчивая тенденция к возрастанию числа смертельных исходов, что, в свою очередь, представляет серьезную социально-экономическую проблему (Козлов, Голуб, 20011; Титов, 2003).
Ключевым фактором патогенности ГОБ считается липополисахарид (ЛПС) - неизменный структурный компонент клеточной стенки ГОБ, биологические эффекты которого реализуются в результате лизиса бактериальных клеток. ЛПС преимущественно известны как индукторы системных воспалительных реакций, обладают широкой биологической активностью, являясь, например, эндотоксинами, соматическими антигенами и специфическими рецепторами бактериофагов (Opal, 2003; Варбанец, 2006; Opal, 2010).
На фоне массового и бесконтрольного приема антибактериальных, противогрибковых, противовирусных и других химиотерапевтических препаратов наблюдается ярко выраженное снижение иммунореактивности организма и, соответственно, снижение его защитных свойств. В связи с этим резко возрос интерес современной медицинской и биологической
наук в разработке и применении препаратов, воздействующих на иммунитет больных с заболеваниями, которые характеризуются вялым, рецидивирующим течением с устойчивостью к адекватной этиотропной терапии. В клинической практике для восстановления иммунитета после перенесенного хронического заболевания любой этиологии принято использовать иммуномодуляторы, которые широко представлены на фармацевтическом рынке в России, однако, конкретно иммунокорректоров бактериального происхождения в разработке не так много и применяются они достаточно редко, несмотря на то, что их эффективность все чаще обсуждается и научно доказывается (Boroni Moreira, 2012; Niederbichler et.al, 2011). Именно поэтому совершенствование методик получения
фракций ЛПС в достаточном количестве весьма актуально и необходимо как для изучения ЛПС-обусловленных биологических эффектов, так и для разработки новых подходов к иммунотерапии.
Цель исследования. Разработка эффективного метода получения высокочистого препарата ЛПС из клеточной стенки бактериальной клетки.
Задачи исследования
1. Проведение анализа существующих методов экстракции ЛПС из бактериальной клетки.
2. Оптимизация условий проведения процедуры выделения высокочистого препарата ЛПС из клеточной стенки грамотрицательных бактерий на примере Escherichia coli.
3. Проведение анализа фракций элюатов ЛПС с помощью ЯМР- спектроскопии для выбора наиболее лучшей методики экстракции ЛПС и оценки её эффективности и степени производительности.
Практическая значимость.
Разработан высокоэффективный и высокопроизводительный метод получения чистого препарата ЛПС из клеточной стенки E. coli, освобожденного от большей части контаминирующих высокомолекулярных органических соединений.
Область применения результатов исследования.
Новый метод выделения препаратов ЛПС из клеточной стенки бактериальных клеток в перспективе может быть использован для получения субстанций ЛПС и/или его фракций в достаточном количестве для производства иммуномодулирующих препаратов, имеющих ряд преимуществ над синтетическими и полусинтетическими препаратами.
1. Анализ полученных данных позволил выбрать наиболее лучшую методику выделения ЛПС, характеризующуюся более высокой эффективностью, производительностью и позволяющую освобождаться от большей части контаминирующих высокомолекулярных органических соединений, в том числе от нуклеиновых кислот.
2. В ходе проведения экспериментов была продемонстрирована эффективность применения колоночной хроматографии для выделения ЛПС грамотрицательных бактерий с применением в качестве неподвижной фазы силикагеля и проведение элюции в градиентном режиме путем последовательной смены смесей растворителей.
3. Новый метод выделения препаратов ЛПС из клеточной стенки бактериальных клеток в перспективе может быть использован для получения субстанций ЛПС и/или его фракций в достаточном количестве для производства иммуномодулирующих препаратов, имеющих ряд преимуществ над синтетическими и полусинтетическими препаратами.
