Список сокращений и условных обозначений 3
ВВЕДЕНИЕ 4
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Представление о Campylobacter spp. 6
1.2. Роль Campylobacter spp. при воспалительных заболеваниях 8
кишечника
1.3. Участие микробиоты кишечника при развитии ВЗК 10
1.4. Эпидемиология и этиология НЯК 12
1.5. Участие Campylobacter spp. при патологических процессах НЯК 15
1.6. Клинико-лабораторные методы исследования Campylobacter 21
spp.
1.7. Диагностика НЯКа у пациентов 26
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Получение и парафинизация материала 30
2.2 Выделение ДНК из материала и депарафинизация 33
2.3 Выделение ДНК с использованием магнитных частиц 37
2.4 Проведение ПЦР в режиме реального времени 40
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1 Получение ткани, фиксированной в формалин, и заключенная в 43 парафин
3.2 Выделение ДНК с помощью магнитных частиц 44
3.3 Подбор условий для амплификации ДНК 45
3.4 Проведение ПЦР RealTime 46
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 48
ВЫВОДЫ 49
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 50
Актуальность проблемы. Неспецифический язвенный колит - заболевание, представляющее собой диффузное воспаление слизистой оболочки кишечника, ограниченное лишь пределами толстой кишки с поражениями прямой кишки и с образованием множественных язв.
Эпидемиологическая картина язвенного колита в целом по России неизвестна. Распространенность в мире 100-350 случаев на 150 тысяч населения. Ежегодный прирост пациентов в мире составляет около 30-50 случаев на 200 тысяч человек. Заболевание встречается во всех возрастных группах, но его основной пик приходится на 18-50 лет. Смертность от воспалительных заболеваний кишечника, включая неспецифический язвенный колит, составляет 10 случаев на 500 тыс. человек в мире и 50 случаев на 1 миллион человек в России. В России в большинстве случаев диагноз ставится с опозданием, через несколько лет после появления первых симптомов заболевания.
Данная болезнь несет в себе серьезные проблемы для колопроктологов и гастроэнтерологов. Он занимает одно из главных мест среди желудочно- кишечных заболеваний по причине своей тяжести, частоте осложнений и смертности. Причины язвенного колита точно не определены и являются предметом бесконечных исследований и предметом многочисленных дискуссий.
Существуют косвенные доказательства того, что бактерии, проникающие в ткани толстой кишки, могут иметь отношение к возбуждению заболевания. Не исключается возможность участия Campylobacter spp., так как они инвазийны и поражают те же органы желудочно-кишечного тракта, что и неспецифический язвенный колит.
Данная тема детерминирована необходимостью расширения
теоретическим и/или эмпирическим путем доказательной базы влияния бактерий Campylobacter spp. на заболеваемость неспецифическим язвенным колитом как одним из самых распространенных форм болезней ЖКТ, "подкашивающим" молодое, экономически активное население, а также выявлением основных причин неуклонного роста заболеваемости, как в мире, так и в России.
Цель работы: Сравнительная оценка методов диагностики
неспецифического язвенного колита и оптимизация способов детекции бактерий Campylobacter spp.
Задачи исследования:
1. Сбор образцов ткани и/или парафиновых блоков, полученных в процессе колоноскопии пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника.
2. Выделение, очистка и формирование коллекции ДНК из образцов ткани
и/или парафиновых блоков для последующего молекулярно -
генетического тестирования.
3. Сравнительная оценка методов диагностики НЯК
4. Оптимизация способов детекции бактерий Campylobacter spp.
При использовании стандартной диагностики бактерий рода Campylobacter значительно увеличивается время ожидания результатов и несет в себе некоторые сложности, например, как ошибки на фоне человеческого фактора и условия культивирования данных бактерий.
В случае НЯК нельзя растягивать время и нужно сразу переходить к лечению, чтобы избежать перехода болезни в хроническую форму, для этого необходимо улучшить методы лабораторной диагностики, чтобы повысить эффективность и быстроту детекции бактерий.
Внедрение в лабораторную диагностику при НЯК ПЦР в режиме реального времени может значительно упростить и повысить результативность детекции Campylobacter spp.
ПЦР реального времени несет множество плюсов, таких как отсутствии стадии электрофореза, автоматизация метода, регистрация и интерпретация результатов, полученных в процессе, что несет уменьшение ложноположительных результатов.
Для проведения ПЦР анализа были подобраны родоспецифичные праймеры и гены-мишени, также режим амплификации.
