Особенности генетической трансформации растений при помощи штамма К599 Agrobacterium rhizogenes
|
Список сокращений и условных обозначений 4
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. Род Agrobacterium/Rhizobium, физиологические и генетические
свойства, разнообразие, таксономическое положение, основные представители - патогены растений 8
1.1.1. Систематическое положение рода Agrobacterium 8
1.1.2. Физиологические признаки рода Agrobacterium 9
1.1.3. Вирулентность и распространение бактерий рода Agrobacterium. 11
1.1.4. Другие инфекционные и неинфекционные заболевания, сходные с
бородатостью корней по симптомам 13
1.2. Молекулярный механизм трансформации растений и использование
бактерий рода Agrobacterium в генной инженерии 13
1.3. Геном штамма К599 Agrobacterium rhizogenes 16
1.3.1. Rol-гены штамма К599 Agrobacterium rhizogenes 17
1.3.2. Морфологические эффекты и функции rol-генов A, B, C и D 17
1.4. Применение волосовидных корней в биотехнологии и
промышленности 20
1.5. Вывод по главе 1 21
ГЛАВА 2: МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 22
2.1. Объекты исследования 22
2.2. Использованные реактивы 22
2.3. Приборы 23
2.4. Составы сред 24
2.5. Метод агробактериальной трансформации 26
2.5.1. Подготовка к трансформации Agrobacterium rhizogenes 26
2.5.2. Инокуляция и совместное культивирование 27
2.5.3. Промывка эксплантов и начало культивирования 28
2.6. Каллусообразование корней 29
2.7. Укоренение побегов 29
2.8. Электропорация агробактерий 29
2.9. Выделение ДНК 31
2.10. Изучение и подбор соответствующих праймеров на го/-гены 32
2.11. Полимеразная цепная реакция 32
2.12. Аналитический гель-электрофорез ДНК 33
2.13. Статистическая обработка результатов 33
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 33
3.1 Агробактериальная трансформация табака 34
3.1.1 Появление точек регенерации на эксплантах табака 34
3.1.2. Пересадка регенерантов 36
3.1.3. Пересадка волосовидных корней 38
3.1.4. Побеги, которые дали корни без добавления гормонов 38
3.1.5. Волосовидные корни, которые дали побеги без гормонов 39
3.1.6. Каллусообразование и появление побегов из волосовидных корней 40
3.1.7. Морфология трансгенного и нетрансгенного побега после
трансформации 41
3.1.8. Акклиматизация трансгенных растений на почве 43
3.2. Результаты ПЦР-анализа 44
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 53
ВЫВОДЫ 55
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 56
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. Род Agrobacterium/Rhizobium, физиологические и генетические
свойства, разнообразие, таксономическое положение, основные представители - патогены растений 8
1.1.1. Систематическое положение рода Agrobacterium 8
1.1.2. Физиологические признаки рода Agrobacterium 9
1.1.3. Вирулентность и распространение бактерий рода Agrobacterium. 11
1.1.4. Другие инфекционные и неинфекционные заболевания, сходные с
бородатостью корней по симптомам 13
1.2. Молекулярный механизм трансформации растений и использование
бактерий рода Agrobacterium в генной инженерии 13
1.3. Геном штамма К599 Agrobacterium rhizogenes 16
1.3.1. Rol-гены штамма К599 Agrobacterium rhizogenes 17
1.3.2. Морфологические эффекты и функции rol-генов A, B, C и D 17
1.4. Применение волосовидных корней в биотехнологии и
промышленности 20
1.5. Вывод по главе 1 21
ГЛАВА 2: МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 22
2.1. Объекты исследования 22
2.2. Использованные реактивы 22
2.3. Приборы 23
2.4. Составы сред 24
2.5. Метод агробактериальной трансформации 26
2.5.1. Подготовка к трансформации Agrobacterium rhizogenes 26
2.5.2. Инокуляция и совместное культивирование 27
2.5.3. Промывка эксплантов и начало культивирования 28
2.6. Каллусообразование корней 29
2.7. Укоренение побегов 29
2.8. Электропорация агробактерий 29
2.9. Выделение ДНК 31
2.10. Изучение и подбор соответствующих праймеров на го/-гены 32
2.11. Полимеразная цепная реакция 32
2.12. Аналитический гель-электрофорез ДНК 33
2.13. Статистическая обработка результатов 33
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 33
3.1 Агробактериальная трансформация табака 34
3.1.1 Появление точек регенерации на эксплантах табака 34
3.1.2. Пересадка регенерантов 36
3.1.3. Пересадка волосовидных корней 38
3.1.4. Побеги, которые дали корни без добавления гормонов 38
3.1.5. Волосовидные корни, которые дали побеги без гормонов 39
3.1.6. Каллусообразование и появление побегов из волосовидных корней 40
3.1.7. Морфология трансгенного и нетрансгенного побега после
трансформации 41
3.1.8. Акклиматизация трансгенных растений на почве 43
3.2. Результаты ПЦР-анализа 44
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 53
ВЫВОДЫ 55
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 56
Актуальность. Разные виды Agrobacterium поражают более 140 видов двудольных растений, принадлежащих 93 семействам [41]. Agrobacterium rhizogenes (син. Rhizobium radiobacter) - вид грамотрицательных, облигатно аэробных почвенных бактерий семейства Rhizobiaceae. A. rhizogenes - обитают в почве и вызывают образование волосовидных корней на месте ранения и заражения у двудольных и некоторых других групп растений. Ri- плазмида агробактерий кодирует генный локус rol (англ. root locus), который содержит гены rolA, rolB и rolC, иногда еще rolD. Данные гены встраиваются в геном клетки-хозяина. Такая генетическая трансформация может вызывать образование сильно разветвленных волосовидных корней на месте заражения [47].
В биотехнологических лабораториях мира наиболее популярными являются штаммы АТСС15834 и А4. Корни, полученные A. rhizogenes штамма А4 более разветвленные («косматые») и новые волосовидные корни на семядольных эксплантах продолжают формироваться в течение 2 месяцев, тогда как после трансформации штаммом 15834 новые корни образовываются только в течение первого месяца. Для корневых культур, полученных обоими типами штаммов, помимо плагиотропного роста корней, было характерно их быстрое ветвление на фоне не столь хорошо выраженного апикального роста кончиков корней, что приводило к очень плотному переплетению образующихся боковых корней [46].
Штамм А4 характеризуется более толстыми и темными корнями с большим количеством коротких, растущих вертикально вверх «пушистых» корешков, имеющих потемневший кончик и иногда останавливающихся в росте через месяц культивирования на жидкой среде MS.
Трансформация штаммом 15834 отличается от трансформации штаммом А4 меньшей толщиной корней, отсутствием потемнения кончиков корней и замедление их роста не фиксировалось ни у одной линии, по крайней мере, через 1 месяц после отделения от материнского экспланта.
Использование диких штаммов, полученных методами генной инженерии, штаммов бактерий с модифицированными Ri-плазмидой и Ti- плазмидой, или комбинированных с плазмидами (содержащие гены rol вместе или по отдельности), так же повышало вирулентность агробактерии (Valdes et al., 2016). Фенотипические эффекты, наблюдаемые в линиях растений Ri, являются прямым следствием процессов переноса, интеграции и экспрессии Т-ДНК Ri-плазмиды в клетку растения-хозяина. После успешного завершения этапов генетической трансформации многие из генов T-ДНК вызывают сильные морфогенные эффекты, которые возникают в результате изменений метаболизма растительных гормонов и чувствительности клеток к ним [51].
Культуры волосовидных корней в биотехнологическом производстве могут подвергаться отрицательному влиянию изменений состава среды, температуры, и т.д., поэтому создание не только высокопродуктивных, но и стрессоустойчивых волосовидных корней весьма актуально.
Личный вклад автора. Автор принимал личное участие во всех этапах исследований, а именно в постановке целей, задач, разработке плана, экспериментальных исследованиях, обработке, анализе и интерпретации полученных данных.
Предмет исследования: особенности инфекционного процесса при трансформации штаммом К599, в отличие от классических штаммов A. rhizogenes А4 и 15834.
Объектом исследования является Agrobacterium rhizogenes штамма К599.
Цель исследования: Определение особенностей штамма К599 Agrobacterium rhizogenes при генетической трансформации растений.
Задачи исследования:
1. Провести агробактериальную трансформацию листовых эксплантов табака при помощи штамма К599 Agrobacterium rhizogenes;
2. Получить волосовидные корни и регенеранты побегов на эксплантах табака;
3. Получить культуры волосовидных корней и укоренить побеги, полученные при помощи штамма К599 Agrobacterium rhizogenes;
4. Доказать трансгенный статус волосовидных корней и растений, полученных после генетической трансформации при помощи штамма К599 Agrobacterium rhizogenes.
5. Определить особенности штамма К599 при агробактериальной трансформации растений.
Дипломная работа выполнена на базе Института биохимии и генетики - обособленное структурное подразделение Федерального государственного бюджетного научного учреждения Уфимского федерального
исследовательского центра Российской академии наук в лаборатории геномики растений под руководством заведующего лабораторией, д.б.н. Кулуева Булата Разяповича.
В биотехнологических лабораториях мира наиболее популярными являются штаммы АТСС15834 и А4. Корни, полученные A. rhizogenes штамма А4 более разветвленные («косматые») и новые волосовидные корни на семядольных эксплантах продолжают формироваться в течение 2 месяцев, тогда как после трансформации штаммом 15834 новые корни образовываются только в течение первого месяца. Для корневых культур, полученных обоими типами штаммов, помимо плагиотропного роста корней, было характерно их быстрое ветвление на фоне не столь хорошо выраженного апикального роста кончиков корней, что приводило к очень плотному переплетению образующихся боковых корней [46].
Штамм А4 характеризуется более толстыми и темными корнями с большим количеством коротких, растущих вертикально вверх «пушистых» корешков, имеющих потемневший кончик и иногда останавливающихся в росте через месяц культивирования на жидкой среде MS.
Трансформация штаммом 15834 отличается от трансформации штаммом А4 меньшей толщиной корней, отсутствием потемнения кончиков корней и замедление их роста не фиксировалось ни у одной линии, по крайней мере, через 1 месяц после отделения от материнского экспланта.
Использование диких штаммов, полученных методами генной инженерии, штаммов бактерий с модифицированными Ri-плазмидой и Ti- плазмидой, или комбинированных с плазмидами (содержащие гены rol вместе или по отдельности), так же повышало вирулентность агробактерии (Valdes et al., 2016). Фенотипические эффекты, наблюдаемые в линиях растений Ri, являются прямым следствием процессов переноса, интеграции и экспрессии Т-ДНК Ri-плазмиды в клетку растения-хозяина. После успешного завершения этапов генетической трансформации многие из генов T-ДНК вызывают сильные морфогенные эффекты, которые возникают в результате изменений метаболизма растительных гормонов и чувствительности клеток к ним [51].
Культуры волосовидных корней в биотехнологическом производстве могут подвергаться отрицательному влиянию изменений состава среды, температуры, и т.д., поэтому создание не только высокопродуктивных, но и стрессоустойчивых волосовидных корней весьма актуально.
Личный вклад автора. Автор принимал личное участие во всех этапах исследований, а именно в постановке целей, задач, разработке плана, экспериментальных исследованиях, обработке, анализе и интерпретации полученных данных.
Предмет исследования: особенности инфекционного процесса при трансформации штаммом К599, в отличие от классических штаммов A. rhizogenes А4 и 15834.
Объектом исследования является Agrobacterium rhizogenes штамма К599.
Цель исследования: Определение особенностей штамма К599 Agrobacterium rhizogenes при генетической трансформации растений.
Задачи исследования:
1. Провести агробактериальную трансформацию листовых эксплантов табака при помощи штамма К599 Agrobacterium rhizogenes;
2. Получить волосовидные корни и регенеранты побегов на эксплантах табака;
3. Получить культуры волосовидных корней и укоренить побеги, полученные при помощи штамма К599 Agrobacterium rhizogenes;
4. Доказать трансгенный статус волосовидных корней и растений, полученных после генетической трансформации при помощи штамма К599 Agrobacterium rhizogenes.
5. Определить особенности штамма К599 при агробактериальной трансформации растений.
Дипломная работа выполнена на базе Института биохимии и генетики - обособленное структурное подразделение Федерального государственного бюджетного научного учреждения Уфимского федерального
исследовательского центра Российской академии наук в лаборатории геномики растений под руководством заведующего лабораторией, д.б.н. Кулуева Булата Разяповича.
Культура hairy roots хозяйственно-ценных видов растений, специфически сверхпродуцирующих ценные метаболиты является перспективной технологией культивирования органов для синтеза, накопления и регуляции производства целевых соединений, благодаря их способности к быстрому росту в недорогой культуральной среде без фитогормонов и возможности длительного культивирования с сохранением генетической и биохимической стабильности. Индукция таких бородатых корней происходит в результате естественной трансформации растительного организма почвенной агробактерией Agrobacterium rhizogenes.
В ходе проведенных экспериментов нами получены взрослые трансгенные по roZ-генам растения табака. На эксплантах листьев этих трансгенных растений на безгормональных питательных средах индуцировалось образование волосовидных корней. Это позволяет сделать заключение о том, что регенерирующая способность N. tabacum достаточно высока, что дает возможность использование такого способа для устойчивого сохранения культур hairy roots с полезными признаками в течение длительного времени. Также нами получены семена у трансгенных растений и планируются работы по получению растений с roZ-генами второго поколения и проведению их морфофизиологического анализа при нормальных и стрессовых условиях.
Почвенная агробактерия A. rhizogenes трансформирует растения так называемыми roZ-генами, что и приводит к неопластическому
плагиотропному разрастанию корней, фактически соответствующих ювенильному растению. В настоящее время экспериментаторы по всему миру применяют в фундаментальных и прикладных исследованиях для получения волосовидных корней не менее 90 штаммов A. rhizogenes. Некоторые из них используются довольно редко, тогда как другие можно считать гораздо более «популярными». При этом в подавляющем
большинстве работ использованы два атропиновых штамма: ATCC15834 и A4, отличающиеся довольно высокой степенью вирулентности.
A. rhizogenes штамма K599 обладает высокой инфекционностью на различных растениях. Особенностью данного штамма атробактерий является то, что под их действием образуются не только волосовидные корни, но происходит и побегообразование. При этом методом ПЦР-анализа нам удалось доказать, что формирующиеся побети являются транстенными. Трансгенные волосовидные корни могут быть непосредственно использованы для изучения генов, функций плазмид и взаимодействий между растениями и их корневыми вредителями; они могут быть использованы в качестве биореакторов для производства активных ингредиентов лекарственных растений, а также могут быть использованы для регенерации полных трансгенных растений. Культуры волосовидных корней обладают многими преимуществами, включая высокий и непрерывный выход широкого спектра метаболитов и высокий потенциал роста на относительно дешевых питательных средах без фитогормонов.
В ходе проведенных экспериментов нами получены взрослые трансгенные по roZ-генам растения табака. На эксплантах листьев этих трансгенных растений на безгормональных питательных средах индуцировалось образование волосовидных корней. Это позволяет сделать заключение о том, что регенерирующая способность N. tabacum достаточно высока, что дает возможность использование такого способа для устойчивого сохранения культур hairy roots с полезными признаками в течение длительного времени. Также нами получены семена у трансгенных растений и планируются работы по получению растений с roZ-генами второго поколения и проведению их морфофизиологического анализа при нормальных и стрессовых условиях.
Почвенная агробактерия A. rhizogenes трансформирует растения так называемыми roZ-генами, что и приводит к неопластическому
плагиотропному разрастанию корней, фактически соответствующих ювенильному растению. В настоящее время экспериментаторы по всему миру применяют в фундаментальных и прикладных исследованиях для получения волосовидных корней не менее 90 штаммов A. rhizogenes. Некоторые из них используются довольно редко, тогда как другие можно считать гораздо более «популярными». При этом в подавляющем
большинстве работ использованы два атропиновых штамма: ATCC15834 и A4, отличающиеся довольно высокой степенью вирулентности.
A. rhizogenes штамма K599 обладает высокой инфекционностью на различных растениях. Особенностью данного штамма атробактерий является то, что под их действием образуются не только волосовидные корни, но происходит и побегообразование. При этом методом ПЦР-анализа нам удалось доказать, что формирующиеся побети являются транстенными. Трансгенные волосовидные корни могут быть непосредственно использованы для изучения генов, функций плазмид и взаимодействий между растениями и их корневыми вредителями; они могут быть использованы в качестве биореакторов для производства активных ингредиентов лекарственных растений, а также могут быть использованы для регенерации полных трансгенных растений. Культуры волосовидных корней обладают многими преимуществами, включая высокий и непрерывный выход широкого спектра метаболитов и высокий потенциал роста на относительно дешевых питательных средах без фитогормонов.
