Стабильность генома штаммов бактерий при регенерации после их долговременного хранения методом криоконсервации

Актуальность исследования 4
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 6
1. Важности сохранения штаммов бактерий для медицины и биотехнологии.. .6
1.1 Формирование баз данных 6
1.2 Базы данных микрооргнизмов 7
1.3 Депонирование 7
1.4 Биорепозиторий 8
2 Способы долгосрочного хранения штаммов микроорганизмов 10
2.1 Методы непродолжительного хранения 13
2.1.1 Субкультивирование, или метод перевиваемых культур 13
2.1.2 Хранение под минеральным маслом 14
2.1.3 Вода или водно-солевые растворы 14
2.1.4 Хранение замораживанием 15
2.1.5 Высушивание 15
2.2 Методы продолжительного хранения 16
2.2.1 Консервация путем жидкостной сушки (L-сушка) 17
2.2.2 Лиофилизация микроорганизмов 17
2.2.3 Консервация путем криогенного замораживания 19
2. Строение геномов бактерий: хромосома, хромиды, мобильные генетические
элементы, плазмиды, островки мобильности (ICE-элементы) 22
3.1 Бактериальная хромосома 23
3.2 Мобильные генетические элементы 23
3. 2. 1 Плазмиды 24
3. 2. 2 Инсерционные последовательности (IS-элементы) 30
3. 2. 3 Транспозоны (Tn) 30
3. 2. 4 Бактериофаги 34
3. 2. 4 Интегроны (In) 35
3. 2. 5 Геномные острова 37
3. 3 ICE-элементы 38
4. Изменчивость штаммов бактерий: внутренняя рекомбинационная активность
и горизонтальный перенос генов 40
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 46
2.2.1. Приготовление питательных сред для культивирования бактерий 46
2.2.2. Культивирование бактерий в жидких и твердых средах 47
2.2.3. Подготовка бактерий к криохранению 47
2.2.4. Оживление штаммов бактерий после криохранения 47
2.2.5. Выделение ДНК из бактерий 48
2.2.6. Постановка полимеразной цепной реакции 48
2.2.7. Приготовление 1% агарозного геля для электрофореза 49
2.2.8. Электрофорез в агарозном геле 49
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 50
ВЫВОДЫ 57
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 58

Купить

Актуальность исследования
С развитием биотехнологической отрасли, медицины, сельского хозяйства, где постоянно происходит взаимодействие с разного рода бактериями, как полезными, так и патогенными, появляется острая необходимость в глубоком изучении этих объектов. Этот процесс часто бывает растянут во времени и течении этого времени необходимо сохранить изучаемые изоляты в неизменном состоянии, что является сложной задачей. Сложность заключается в том, что бактерии обладают чрезмерной изменчивостью благодаря внутренней рекомбинации генома и горизонтальному переносу генов. Именно из-за этого вначале зарождения микробиологии как науки происходила потеря фенотипических признаков у выделенных изолятов в течение определенного времени и это приводило к значительным проблемам. На сегодняшний день метод пассажей уже уходит в историю и на его место приходят более современные способы долго срочного хранения бактерий. Наиболее эффективным методом и используемым в настоящее время во всех банках хранения бактерий является способ криоконсервации, при котором культура микроорганизмов в смеси с криопротектором замораживается при низких температурах, имеющих значение ниже -72С. Считается что при таком способе в бактериях полностью ингибируются все процессы, в том числе и рекомбинационные, что приводит к сохранности и неизменности геномов бактерий, и соответственно к сохранению фенотипов микроорганизмов.
Цель исследования.
Выявить влияние способа криохранения на внутреннюю рекомбинационную активность бактерий, ведущую к изменению их фенотипа.
Задачи исследования.
1. Получить флуоресцентно меченные лабораторные штаммы E.coli XL-Blue и дикие штаммы клубеньковых бактерий R.leguminosarum ГЛ3, R.leguminosarum ГЛ9 Sinorhizobium meliloti Mlu10 путем трансформации их плазмидным вектором, несущим гены флуоресцентных белков.
2. С использованием маркированных штаммов E.coli, выявить стабильность мобильной части генома бактерий при обычном культивировании на питательных средах.
3. Провести анализ влияния способа долгосрочного хранения на потери фенотипических признаков, детерминированных на плазмиде.

Купить