МОЛЕКУЛЯРНО- ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДЕТЕКЦИЯ ФРАГМЕНТОВ ДНК ОСТРОВА ГЕНОТОКСИЧНОСТИ (pks) ESCHERICHIA COLI NC101 В БИОПТАТАХ ПРИ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ КИШЕЧНИКА.

ВВЕДЕНИЕ 4
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1. Предпосылки развития рака 7
1.2. Микробиота- метаболический «орган» 9
1.3. Образование и роль биопленки 12
1.4. Нарушение микробиоты 13
1.5. Штамм E. coli NC101 16
1.6. Колибактин- новый бактериальный токсин 18
1.7. Колибактин и колоректальный рак 21
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 23
2.1. Лабораторное обследование больных 23
2.2. Выделение ДНК бактерий из кала 23
2.3. Депарафинизация и оптимизация метода выделения ДНК из 26 ткани, фиксированной в формалине и заключенной в парафин
2.4. Выбор праймеров для исследования 27
2.5. Амплификация участков ДНК методом полимеразной цепной 28
реакции
2.6. Электрофоретический анализ ДНК в агарозном геле 32
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 33
3.1. Проверка выделенной ДНК из биоптатов 33
3.2. Выбор праймеров к островкам патогенности pks 34
3.3. Детекция «острова» патогенностиpks в образцах кала 34
3.4. Детекция «острова» патогенности pks в биоптатах при 36
воспалительных заболеваниях
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 38
ВЫВОДЫ 39
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 40
ПРИЛОЖЕНИЕ 52
Купить

Актуальность проблемы. Данные Всемирной организации Здравоохранения свидетельствуют о том, что рак является одной из основных причин смертности во всем мире. Онкологическая патология по количеству смертельных исходов уступает только сердечно-сосудистым заболеваниям. Каждый год во всем мире от рака умирает более 7,5 миллионов человек.
Одним из распространенных видов карцином считается рак толстой кишки. Под этим термином понимают образование злокачественной эпителиальной опухоли кишки различной формы, локализации и гистологической структуры. С каждым годом количество больных возрастает. В России рак толстой кишки занимает 4-е место среди других онкологических заболеваний.
В настоящее время актуальным направлением в исследовании рака толстой кишки является изучение видовой структуры сообщества симбиотических микроорганизмов и закономерностей ее организации (Варичев и др., 2012). Одним из таких микроорганизмов является Escherichia coli. Они относятся к условно-патогенной микробиоте кишечника и находятся в эпителиальной слизи. Однако высокая пластичность генома E. coli дает огромный потенциал для развития и появления штаммов патогенных микроорганизмов из комменсальных штаммов (Bouguened et al., 2006), например, через обмен любыми генетическими элементами разных типов бактерий между собой и с другими представителями семейства Enterobacteriaceae (Иванова и др., 2014). Патогенные изоляты E. coli являются основной причиной бактериальных диарей во всем мире (Bouguened et al., 2006). Они обладают генами, кодирующими различные факторы вирулентности, которые часто иммобилизуются на мобильных генетических элементах, такие как бактериофаги, плазмиды и «острова» («островки») патогенности
5 (Sokurenko et al., 1999; Ochman et al., 2000; Мавзютов, Фиалкина, Бондаренко, 2002; Alfredo et al., 2005; Croxen et al., 2010).
«Островки патогенности» (ОП) - разновидность генетических островков, содержащих от одного до нескольких десятков генов, кодирующих факторы патогенности, и способных к одновременной горизонтальной внутривидовой и межвидовой передаче. Островки патогенности присутствуют только у вирулентных микроорганизмов в составе плазмид или бактериальной хромосомы. Доказано, что этиологической значимостью обладает E.coli, эти бактерии могут привести к повреждению ДНК в клетках кишечника и способствовать развитию рака толстой кишки (Christine Hsu, 2012).
Существуют некоторые штаммы E coli, которые содержат геномный остров поликетидсинтазы (pks), чья функция заключается в кодировании мультиферментативного механизма, который производит генотоксическое вещество, называемое колибактин. Колибактин может вызывать клеточное старение или рак, повреждая ДНК. Тем не менее, барьер слизистой оболочки препятствует достижению E. coli к поверхности энтероцитов. Только тогда, когда совместно с инфекцией E. coli развиваются некоторые воспалительные поражения, бактерия способна вводить колибактин в энтероциты, вызывая развитие опухоли (Holmes et al., 2008). Островки генотоксичности являются маркерами того, что E. coli является одной из причин развития рака толстой кишки.
Цель исследования. Оценка роли вариантов E coli NC 101, несущих островаpks в этиологии воспалительных заболеваний кишечника.
Задачи исследования:
1. Сбор клинического материала.
2. Выделение ДНК из биоптатов кишечника и кала у пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника.
3. Выбор праймеров к островкам патогенности pks и оптимизация их работы для молекулярно-генетической идентификации.
4. Подбор оптимального метода генетической идентификации.
5. Сравнение результатов молекулярно-генетической детекции ДНК из биоптатов и ДНК из кала.
Научная новизна. Данная тест система может применяться для амплификации и секвенирования поликетидной синтетазы
генотоксических островов E coli NC 101 в биоптатах кишечника и в кале, с целью обнаружения влияния на развитие рака толстой кишки при воспалительных заболеваниях кишечника.
Практическая значимость. Применение тест системы для ранней диагностики рака толстой кишки.
Область применения результатов исследования. В клинической медицине для выявления и дальнейших действий при воспалительных заболеваниях кишечника с целью профилактики развития рака толстой кишки.

Купить