ПРИМЕНЕНИЕ ВЕКТОРНОЙ ПЛАЗМИДЫ pAL-TA, НЕСУЩЕЙ ФРАГМЕНТ ГЕНА 16S РРНК STREPTOCOCCUS SOBRINUS, ДЛЯ СРАВНИТЕЛЬНОЙ ОЦЕНКИ АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТИ ХИМИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ В ОТНОШЕНИИ ГРАМ+ БАКТЕРИЙ
|
Список сокращений и условных обозначений 4
ВВЕДЕНИЕ. 5
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1. Инфекционные заболевания, вызываемые грамположительными бактериями 9
1.2. Антибиотики с выраженной активностью в отношении грамположительных бактерий 12
1.3. Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам 15
1.3.1. Диско-диффузионный метод (ДДМ) 15
1.3.2. Метод серийных разведений 17
1.3.3. Эпсилометрический тест (Е-тест) 19
1.3.4. ДНК-ДНК-гибридизация для выявления генов антибиотикорезистентности 19
1.3.5. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 21
1.3.6. ПЦР в реальном времени (РТ-ПЦР) 22
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 25
2.1.Объекты исследования 25
2.2. Приготовление питательных сред для культивирования Streptococcus sobrinus 30
2.3. Конструирование положительного образца 36
2.4. Выделение бактериальной ДНК из выросших колоний 36
2.5. Проведение стандартной полимеразной цепной реакции (ПЦР) 37
2.6.Электрофретическая детекция продуктов амплификации 38
2.7.Проведение ПЦР в режиме реального времени (РТ-ПЦР) 40
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 42
3.1. Конструирование калибратора для количественной оценки содержание Streptococcus sobrinus 42
3.2. Определение величины минимальной подавляющей концентрации (МИК) исследуемых антибиотиков 48
3.3.Экспериментальная оценка сконструированного калибратора на антибактериальных препаратах 50
3.4.Молекулярно-генетическая оценка антимикробной активности исследуемых антибиотиков 54
ВЫВОДЫ 66
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 67
ПРИЛОЖЕНИЕ 75
ВВЕДЕНИЕ. 5
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1. Инфекционные заболевания, вызываемые грамположительными бактериями 9
1.2. Антибиотики с выраженной активностью в отношении грамположительных бактерий 12
1.3. Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам 15
1.3.1. Диско-диффузионный метод (ДДМ) 15
1.3.2. Метод серийных разведений 17
1.3.3. Эпсилометрический тест (Е-тест) 19
1.3.4. ДНК-ДНК-гибридизация для выявления генов антибиотикорезистентности 19
1.3.5. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 21
1.3.6. ПЦР в реальном времени (РТ-ПЦР) 22
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 25
2.1.Объекты исследования 25
2.2. Приготовление питательных сред для культивирования Streptococcus sobrinus 30
2.3. Конструирование положительного образца 36
2.4. Выделение бактериальной ДНК из выросших колоний 36
2.5. Проведение стандартной полимеразной цепной реакции (ПЦР) 37
2.6.Электрофретическая детекция продуктов амплификации 38
2.7.Проведение ПЦР в режиме реального времени (РТ-ПЦР) 40
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 42
3.1. Конструирование калибратора для количественной оценки содержание Streptococcus sobrinus 42
3.2. Определение величины минимальной подавляющей концентрации (МИК) исследуемых антибиотиков 48
3.3.Экспериментальная оценка сконструированного калибратора на антибактериальных препаратах 50
3.4.Молекулярно-генетическая оценка антимикробной активности исследуемых антибиотиков 54
ВЫВОДЫ 66
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 67
ПРИЛОЖЕНИЕ 75
Актуальность. Инфекционные заболевания являются серьезной проблемой здравоохранения. Ежегодно инфекции бактериальной этиологии уносят сотни тысяч жизней, а многие переболевшие получают неизлечимые осложнения на всю оставшуюся жизнь (Семенова и др., 2008). По статистике, именно инфекционные заболевания становятся причиной 26% всех смертей на планете (по данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) за 2008 год). В 2013 г. на территории Российской Федерации было зарегистрировано более 33 млн. 225 тыс. инфекционных заболеваний, что значительно превышает данные за 2012 г. (31 млн. 477 тыс. случаев) (Пономарев, Яковлев, 2017).
На сегодняшний день особо актуальной представляется проблема возрастания случаев заболеваемости инфекционными болезнями, вызываемыми грамположительными бактериями (Wing Fei Wong, Santiago, 2017). В частности, основной причиной развития инфекций являются так называемые «проблемные» микроорганизмы - метициллин-резистентные стафилококки, встречающиеся повсеместно и являющиеся возбудителями пневмоний, инфекций кожи, мягких тканей, костей и суставов (Shopsin et al., 2000). Не уступают по распространенности инфекционные
заболевания, вызываемые представителями рода Streptococcus spp. Стрептококковые инфекции входят в число наиболее острых проблем здравоохранения во всех странах мира (Rice, 2006). По данным ВОЗ в мире ежегодно возникает свыше 111 млн. случаев стрептодермии и 616 млн. случаев стрептококковых фарингитов. Тяжелыми заболеваниями, вызванными стрептококками группы А страдает около 18 млн. человек, из них 15,5 млн. человек - ревматическими заболеваниями сердца. Ежегодно регистрируется около 2 млн. новых случаев и умирает свыше 500 тыс. человек. (Покровский, 2009).
Особую важность представляет распространение микроорганизмов, резистентных к антибактериальным препаратам (АБП), что служит причиной существенного ограничения выбора антибиотиков для лечения. (Свистушкин, Мустафаев, 2016). На сегодняшний день активно ведется разработка новых антибактериальных препаратов, обладающих выраженной антимикробной активностью в отношении клинически значимых штаммов микроорганизмов, по новейшим современным технологиям (Fish, Ohlinger, 2006). Поэтому вопрос проверки и тестирования новых препаратов в рамках доклинических исследований становится очень актуальным.
В настоящее время для проверки антимикробной активности применяют фенотипические и генотипические методы, позволяющие провести всесторонние наблюдения за микроорганизмом, определить детерминанты, отвечающие за устойчивость к антибактериальным препаратам и расшифровать природу их устойчивости (Платонов, 2011).
Фенотипические методы предполагают оценку влияния АБП на жизнедеятельность микроорганизмов по таким параметрам, как скорость роста и биохимическая активность (Marie, Coyle, 2005). Среди фенотипических методов хорошо стандартизованными являются методы серийных разведений (в бульоне/агаре) и диффузионные (диско-диффузионный и эпсилометрический (Е-тест), основанные на детекции роста исследуемых культур. (Ashtiani et al., 2008) Стоит отметить, что перечисленные методы не дают полную информацию по действию антибиотиков на микроорганизмы и, кроме того, отличаются высокой трудоемкостью.
Генотипические методы основаны на прямой детекции генов, кодирующих детерминанты устойчивости к АБП (Медведева и др., 2009). Детекцию осуществляют с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) - молекулярно-генетического метода, успешно внедряемого в практику клинической диагностики как для высокоэффективного
7
выявления, так и для количественного определения специфических
участков нуклеиновых кислот, ассоциированных с инфекционными
заболеваниями (Орадова, 2013). Определение антибиотикорезистентного
профиля бактерий не дает возможность проводить данную процедуру
постоянно ввиду высокой вероятности возникновения мутаций в генах,
регулирующих системы выведения АБП из бактериальной клетки и, как
следствие, формирования резистентности в отношении отдельных
антибиотиков (Кафтырева и др., 2012).
Именно поэтому возникает необходимость создания
высокочувствительного, специфичного, малотрудоемкого способа молекулярно-генетической оценки эффективности антимикробных соединений в отношении грамположительных микроорганизмов с возможностью получения количественных данных.
Цель исследования. Разработка технологии проверки
антимикробной активности антибактериальных препаратов в отношении грамположительных бактерий с использованием количественной ПЦР в режиме реального времени.
Задачи исследования
1. Конструирование калибровочного образца pAL-TAStrSob16S известной концентрации для количественной оценки антимикробной активности антибиотиков в отношении Streptococcus sobrinus с помощью метода ПЦР в режиме реального времени.
2. Экспериментальная оценка сконструированного калибратора на антибактериальных препаратах (не менее 5).
3. Разработка системы интерпретации результатов молекулярно - генетического анализа антибактериальной активности препаратов.
4. Апробация разработанных технологий для сравнительной оценки антибактериальных препаратов.
Практическая значимость. Сконструирован калибровочный образец на основе рекомбинантной плазмиды pAL-TAStrSob16S для
количественной оценки противомикробной активности антибактериальных
препаратов в отношении грамположительных бактерий с помощью метода
ПЦР в режиме реального времени.
Область применения результатов исследования. Проведение комплексной оценки противомикробной активности как оригинальных синтетических препаратов, так и новых химических соединений и их производных, получаемых в ряду уже зарекомендовавших себя классов химических соединений с помощью метода ПЦР в режиме реального времени. Предложенная методика может в будущем ускорить процесс подбора тактики лечения инфекционных заболеваний благодаря подбору наиболее эффективного антибактериального препарата в короткие сроки.
На сегодняшний день особо актуальной представляется проблема возрастания случаев заболеваемости инфекционными болезнями, вызываемыми грамположительными бактериями (Wing Fei Wong, Santiago, 2017). В частности, основной причиной развития инфекций являются так называемые «проблемные» микроорганизмы - метициллин-резистентные стафилококки, встречающиеся повсеместно и являющиеся возбудителями пневмоний, инфекций кожи, мягких тканей, костей и суставов (Shopsin et al., 2000). Не уступают по распространенности инфекционные
заболевания, вызываемые представителями рода Streptococcus spp. Стрептококковые инфекции входят в число наиболее острых проблем здравоохранения во всех странах мира (Rice, 2006). По данным ВОЗ в мире ежегодно возникает свыше 111 млн. случаев стрептодермии и 616 млн. случаев стрептококковых фарингитов. Тяжелыми заболеваниями, вызванными стрептококками группы А страдает около 18 млн. человек, из них 15,5 млн. человек - ревматическими заболеваниями сердца. Ежегодно регистрируется около 2 млн. новых случаев и умирает свыше 500 тыс. человек. (Покровский, 2009).
Особую важность представляет распространение микроорганизмов, резистентных к антибактериальным препаратам (АБП), что служит причиной существенного ограничения выбора антибиотиков для лечения. (Свистушкин, Мустафаев, 2016). На сегодняшний день активно ведется разработка новых антибактериальных препаратов, обладающих выраженной антимикробной активностью в отношении клинически значимых штаммов микроорганизмов, по новейшим современным технологиям (Fish, Ohlinger, 2006). Поэтому вопрос проверки и тестирования новых препаратов в рамках доклинических исследований становится очень актуальным.
В настоящее время для проверки антимикробной активности применяют фенотипические и генотипические методы, позволяющие провести всесторонние наблюдения за микроорганизмом, определить детерминанты, отвечающие за устойчивость к антибактериальным препаратам и расшифровать природу их устойчивости (Платонов, 2011).
Фенотипические методы предполагают оценку влияния АБП на жизнедеятельность микроорганизмов по таким параметрам, как скорость роста и биохимическая активность (Marie, Coyle, 2005). Среди фенотипических методов хорошо стандартизованными являются методы серийных разведений (в бульоне/агаре) и диффузионные (диско-диффузионный и эпсилометрический (Е-тест), основанные на детекции роста исследуемых культур. (Ashtiani et al., 2008) Стоит отметить, что перечисленные методы не дают полную информацию по действию антибиотиков на микроорганизмы и, кроме того, отличаются высокой трудоемкостью.
Генотипические методы основаны на прямой детекции генов, кодирующих детерминанты устойчивости к АБП (Медведева и др., 2009). Детекцию осуществляют с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) - молекулярно-генетического метода, успешно внедряемого в практику клинической диагностики как для высокоэффективного
7
выявления, так и для количественного определения специфических
участков нуклеиновых кислот, ассоциированных с инфекционными
заболеваниями (Орадова, 2013). Определение антибиотикорезистентного
профиля бактерий не дает возможность проводить данную процедуру
постоянно ввиду высокой вероятности возникновения мутаций в генах,
регулирующих системы выведения АБП из бактериальной клетки и, как
следствие, формирования резистентности в отношении отдельных
антибиотиков (Кафтырева и др., 2012).
Именно поэтому возникает необходимость создания
высокочувствительного, специфичного, малотрудоемкого способа молекулярно-генетической оценки эффективности антимикробных соединений в отношении грамположительных микроорганизмов с возможностью получения количественных данных.
Цель исследования. Разработка технологии проверки
антимикробной активности антибактериальных препаратов в отношении грамположительных бактерий с использованием количественной ПЦР в режиме реального времени.
Задачи исследования
1. Конструирование калибровочного образца pAL-TAStrSob16S известной концентрации для количественной оценки антимикробной активности антибиотиков в отношении Streptococcus sobrinus с помощью метода ПЦР в режиме реального времени.
2. Экспериментальная оценка сконструированного калибратора на антибактериальных препаратах (не менее 5).
3. Разработка системы интерпретации результатов молекулярно - генетического анализа антибактериальной активности препаратов.
4. Апробация разработанных технологий для сравнительной оценки антибактериальных препаратов.
Практическая значимость. Сконструирован калибровочный образец на основе рекомбинантной плазмиды pAL-TAStrSob16S для
количественной оценки противомикробной активности антибактериальных
препаратов в отношении грамположительных бактерий с помощью метода
ПЦР в режиме реального времени.
Область применения результатов исследования. Проведение комплексной оценки противомикробной активности как оригинальных синтетических препаратов, так и новых химических соединений и их производных, получаемых в ряду уже зарекомендовавших себя классов химических соединений с помощью метода ПЦР в режиме реального времени. Предложенная методика может в будущем ускорить процесс подбора тактики лечения инфекционных заболеваний благодаря подбору наиболее эффективного антибактериального препарата в короткие сроки.
1. Был сконструирован калибратор, который позволяет определить количество микроорганизмов.
2. Применение калибратора, определяет концентрацию микроорганизмов в данном образце.
3. Молекулярно-генетические исследования антимикробной активности исследуемых веществ амикацина, гентамицина, пефлоксацина, цефтриаксона и ципрофлоксацина с различными концентрациями (от 256,0 до 1,0 мкг/мл) показали, что данные вещества действительно подавляют активность роста исследуемого штамма Streptococcus sobrinus.
4. В результате применение Т-системы для сравнения антибиотиков амикацина, гентамицина, пефлоксацина, цефтриаксона и ципрофлоксацина в отношение Streptococcus sobrinus была выявлена наибольшая активность ципрофлоксацина. Данный антибактериальный препарат обладал наибольшей активностью в отношении тестируемого штамма и ингибировал бактериальный рост при самых низких концентрациях. Наименьшей активностью против данного микроорганизма обладал антибиотик амикацин.
2. Применение калибратора, определяет концентрацию микроорганизмов в данном образце.
3. Молекулярно-генетические исследования антимикробной активности исследуемых веществ амикацина, гентамицина, пефлоксацина, цефтриаксона и ципрофлоксацина с различными концентрациями (от 256,0 до 1,0 мкг/мл) показали, что данные вещества действительно подавляют активность роста исследуемого штамма Streptococcus sobrinus.
4. В результате применение Т-системы для сравнения антибиотиков амикацина, гентамицина, пефлоксацина, цефтриаксона и ципрофлоксацина в отношение Streptococcus sobrinus была выявлена наибольшая активность ципрофлоксацина. Данный антибактериальный препарат обладал наибольшей активностью в отношении тестируемого штамма и ингибировал бактериальный рост при самых низких концентрациях. Наименьшей активностью против данного микроорганизма обладал антибиотик амикацин.
