Идентификация гена toxA экзотоксина Pseudomonas aeruginosa и гена pmen_4277 семейства белков MviN Pseudomonas mendocina
|
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5
ВВЕДЕНИЕ 6
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. Распространение 9
1.2. Этиологическое значение 10
1.2.1. Этиологическое значение Pseudomonas aeruginosa 10
1.2.2. Этиологическое значение Pseudomonas mendocina 14
1.3. Морфологические свойства 16
1.4. Культуральные свойства 16
1.5. Продукция факторов патогенности 18
1.5.1. Продукция факторов патогенности P. aeruginosa 18
1.5.2. Продукция факторов патогенности P. mendocina 29
1.6. MALDI-TOF масс-спектрометрия 31
1.7. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 33
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 3 5
2.1. Общая характеристика материала и методов исследования 35
2.2. Бактериологическое исследование 36
2.2.1. Подготовка лабораторной посуды к стерилизации 36
2.2.2. Освоение техники посева клинического материала 37
2.2.3. Посев образцов клинического материала 39
2.2.4. Биохимические особенности неферментирующих 40
грамотрицательных бактерий
2.3. Микроскопия мазка (окраска по Граму) 41
2.4. Идентификация микроорганизмов группы НФГОБ методом 42
масс-спектрометрии
2.5. Поиск и сравнительный анализ последовательностей ДНК- 45
мишеней
2.6. Выделение ДНК неферментирующих грамотрицательных 46
бактерий
2.7. Определение чувствительности и специфичности 48
подобранных последовательностей ДНК-мишеней
2.8. ПЦР генов патогенности неферментирующих 50
грамотрицательных бактерий
2.9. Детекция продуктов ПЦР-амплификации методом агарозного 53
гель-электрофореза
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ 55
ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Выделение клинических штаммов неферментирующих 55
грамотрицательных бактерий
3.2. Бактериологический посев 57
3.3. Микроскопия мазка (окраска по Г раму) 5 9
3.4. Идентификация микроорганизмов группы НФГОБ на 60
MALDI-TOF масс-спектрометре
3.5. Определение антибиотикорезистентности 61
неферментирующих грамотрицательных микроорганизмов
3.5.1. Антибиотикорезистентность штаммов P. aeruginosa 61
3.5.2. Антибиотикорезистентность штаммов P. mendocina 63
3.6. Определение специфичности и чувствительности праймера 63
PsAerug21
3.6.1. Определение специфичности 63
3.6.2. Определение чувствительности 64
3.7. Детекция результатов амплификации гена toxA в геноме 66
штаммов P. aeruginosa
3.8. Определение специфичности и чувствительности праймера 66
PsМen22
3.8.1. Определение специфичности 66
3.8.2. Определение чувствительности 67
3.9. Детекция результатов амплификации генаpmen 4277 в 69
геноме штаммов P. mendocina
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 70
ВЫВОДЫ 74
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 75
Приложение 1 90
Приложение 2 91
Приложение 3 93
ВВЕДЕНИЕ 6
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. Распространение 9
1.2. Этиологическое значение 10
1.2.1. Этиологическое значение Pseudomonas aeruginosa 10
1.2.2. Этиологическое значение Pseudomonas mendocina 14
1.3. Морфологические свойства 16
1.4. Культуральные свойства 16
1.5. Продукция факторов патогенности 18
1.5.1. Продукция факторов патогенности P. aeruginosa 18
1.5.2. Продукция факторов патогенности P. mendocina 29
1.6. MALDI-TOF масс-спектрометрия 31
1.7. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 33
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 3 5
2.1. Общая характеристика материала и методов исследования 35
2.2. Бактериологическое исследование 36
2.2.1. Подготовка лабораторной посуды к стерилизации 36
2.2.2. Освоение техники посева клинического материала 37
2.2.3. Посев образцов клинического материала 39
2.2.4. Биохимические особенности неферментирующих 40
грамотрицательных бактерий
2.3. Микроскопия мазка (окраска по Граму) 41
2.4. Идентификация микроорганизмов группы НФГОБ методом 42
масс-спектрометрии
2.5. Поиск и сравнительный анализ последовательностей ДНК- 45
мишеней
2.6. Выделение ДНК неферментирующих грамотрицательных 46
бактерий
2.7. Определение чувствительности и специфичности 48
подобранных последовательностей ДНК-мишеней
2.8. ПЦР генов патогенности неферментирующих 50
грамотрицательных бактерий
2.9. Детекция продуктов ПЦР-амплификации методом агарозного 53
гель-электрофореза
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ 55
ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Выделение клинических штаммов неферментирующих 55
грамотрицательных бактерий
3.2. Бактериологический посев 57
3.3. Микроскопия мазка (окраска по Г раму) 5 9
3.4. Идентификация микроорганизмов группы НФГОБ на 60
MALDI-TOF масс-спектрометре
3.5. Определение антибиотикорезистентности 61
неферментирующих грамотрицательных микроорганизмов
3.5.1. Антибиотикорезистентность штаммов P. aeruginosa 61
3.5.2. Антибиотикорезистентность штаммов P. mendocina 63
3.6. Определение специфичности и чувствительности праймера 63
PsAerug21
3.6.1. Определение специфичности 63
3.6.2. Определение чувствительности 64
3.7. Детекция результатов амплификации гена toxA в геноме 66
штаммов P. aeruginosa
3.8. Определение специфичности и чувствительности праймера 66
PsМen22
3.8.1. Определение специфичности 66
3.8.2. Определение чувствительности 67
3.9. Детекция результатов амплификации генаpmen 4277 в 69
геноме штаммов P. mendocina
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 70
ВЫВОДЫ 74
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 75
Приложение 1 90
Приложение 2 91
Приложение 3 93
Актуальность проблемы
Особенностью современного этапа развития инфекций является увеличение в их структуре числа заболеваний, вызываемых многочисленными представителями группы грамотрицательных неферментирующих условно-патогенных бактерий. Исследование более 700 клинических штаммов грамотрицательных микроорганизмов, выделенных из образцов отделяемого ран, мокроты и мочи пациентов, показало, что на долю всех случаев выделения неферментирующих грамотрицательных бактерий (НФГОБ) приходится 4,45% в 2009 году, 5,5% в 2010 году и 6,7% в 2011 году (Shaver, Hauser, 2004). Стоит отметить, что наиболее часто неферментирующие грамотрицательные бактерии выявлялись при инфекциях нижних дыхательных путей в 7,1% и при гнойно-септических процессах в 5,1% (Мавзютов и др., 2012). По результатам клинических исследований отечественных ученых было установлено, что 52,3% выделенных штаммов относились к грамотрицательной микрофлоре, удельный вес неферментирующих грамотрицательных бактерий составил 34,4% изучаемых штаммов, среди которых Pseudomonas aeruginosa составила 13,4% высеянных культур (Бисенова и др., 2016).
Актуальность проблемы ранней диагностики инфекционных заболеваний, вызванных неферментирующими грамотрицательными бактериями, обуславливается тем, что бактериальные инфекции при задержке адекватной антибиотикотерапии сопровождаются тяжелыми осложнениями у гематологических больных, пациентов отделений интенсивной терапии, а также у лиц, подвергающихся воздействию неблагоприятных экологических и производственных факторов (Чучалин и др., 2005). Защитные механизмы бактерий рода Pseudomonas позволили сохранить маркеры устойчивости к антибиотикам, деградирующие ферменты и системы секреции, которые влияют на инфекцию человека (Frank, 2012).
Pseudomonas aeruginosa является высоковирулентным возбудителем поздних вентиляционных пневмоний, инфекций мочевыводящих путей, катетер-ассоциированных ангиогенных инфекций, бактериемии, раневых инфекций, инфекций глаз, ожоговых ран (Delden, Iglewski, 2007). Встречаемость P. aeruginosa среди других неферментирующих грамотрицательных возбудителей инфекционных осложнений с годами увеличивается с 11,2% в 1998 г. (Руднов, Зубарев, 2008) до 28,2% в 2012 г. (Хасанова и др., 2012). P. aeruginosa может поражать различные органы и ткани, отмечается, инфицирование жизненно важных органов (легких, сердца) посредством сепсиса кровотока приводит к летальному исходу в 25% случаев (Руднов, 2008).
Опираясь на тот факт, что род Pseudomonas включает виды, имеющие большое этиологическое значение в медицине, можно предположить, что и другие, менее известные, представители рода способны вызывать различные инфекционные заболевания макроогранизма. Pseudomonas mendocina редко встречается в медицинской практике, тем не менее, в литературе описаны случаи, в которых бактерия являлась причиной инфицирования эндокардита (Omote, et al, 2006).
Цель исследования
Подтвердить эффективность использование метода MALDI-TOF масс-спектрометрии для идентификации Pseudomonas aeruginosa и Pseudomonas mendocina и метода молекулярной генетики (классической ПЦР) для обнаружения генов патогенности.
Задачи исследования
1. Выделение чистой культуры НФГОБ;
2. Проведение идентификации методом MALDI-TOF масс-
спектрометрии;
3. Подбор видоспецифичных олигонуклеотидных праймеров;
4. Проведение ПЦР анализа стандартным методом с последующей детекцией результатов;
5. Оценка диагностической ценности исследования.
Научная новизна и теоретическая ценность работы
Впервые для определения этиологической значимости возбудителя заболевания был объединен метод ускоренной идентификации методом MALDI-TOF масс-спектрометрии и определение факторов патогенности микроорганизма молекулярно-генетическим методом с использованием видоспецифичных праймеров.
Научно-практическая значимость
Внедрение результатов исследования в клиническую практику позволит врачам не только ставить точный диагноз, но и предотвращать возможные осложнения различных заболеваний, вызванных неферментирующими грамотрицательными микроорганизмами.
Идентификация возбудителей бактериальных инфекций, вызванных НФГОБ, методом MALDI-TOF масс-спектрометрии и обнаружение патогенных генов НФГОБ молекулярно-генетическим методом ПЦР может стать основой для ранней диагностики, назначения адекватной антибиотикотерапии, мониторинга и прогнозирования течения бактериальных инфекций.
Особенностью современного этапа развития инфекций является увеличение в их структуре числа заболеваний, вызываемых многочисленными представителями группы грамотрицательных неферментирующих условно-патогенных бактерий. Исследование более 700 клинических штаммов грамотрицательных микроорганизмов, выделенных из образцов отделяемого ран, мокроты и мочи пациентов, показало, что на долю всех случаев выделения неферментирующих грамотрицательных бактерий (НФГОБ) приходится 4,45% в 2009 году, 5,5% в 2010 году и 6,7% в 2011 году (Shaver, Hauser, 2004). Стоит отметить, что наиболее часто неферментирующие грамотрицательные бактерии выявлялись при инфекциях нижних дыхательных путей в 7,1% и при гнойно-септических процессах в 5,1% (Мавзютов и др., 2012). По результатам клинических исследований отечественных ученых было установлено, что 52,3% выделенных штаммов относились к грамотрицательной микрофлоре, удельный вес неферментирующих грамотрицательных бактерий составил 34,4% изучаемых штаммов, среди которых Pseudomonas aeruginosa составила 13,4% высеянных культур (Бисенова и др., 2016).
Актуальность проблемы ранней диагностики инфекционных заболеваний, вызванных неферментирующими грамотрицательными бактериями, обуславливается тем, что бактериальные инфекции при задержке адекватной антибиотикотерапии сопровождаются тяжелыми осложнениями у гематологических больных, пациентов отделений интенсивной терапии, а также у лиц, подвергающихся воздействию неблагоприятных экологических и производственных факторов (Чучалин и др., 2005). Защитные механизмы бактерий рода Pseudomonas позволили сохранить маркеры устойчивости к антибиотикам, деградирующие ферменты и системы секреции, которые влияют на инфекцию человека (Frank, 2012).
Pseudomonas aeruginosa является высоковирулентным возбудителем поздних вентиляционных пневмоний, инфекций мочевыводящих путей, катетер-ассоциированных ангиогенных инфекций, бактериемии, раневых инфекций, инфекций глаз, ожоговых ран (Delden, Iglewski, 2007). Встречаемость P. aeruginosa среди других неферментирующих грамотрицательных возбудителей инфекционных осложнений с годами увеличивается с 11,2% в 1998 г. (Руднов, Зубарев, 2008) до 28,2% в 2012 г. (Хасанова и др., 2012). P. aeruginosa может поражать различные органы и ткани, отмечается, инфицирование жизненно важных органов (легких, сердца) посредством сепсиса кровотока приводит к летальному исходу в 25% случаев (Руднов, 2008).
Опираясь на тот факт, что род Pseudomonas включает виды, имеющие большое этиологическое значение в медицине, можно предположить, что и другие, менее известные, представители рода способны вызывать различные инфекционные заболевания макроогранизма. Pseudomonas mendocina редко встречается в медицинской практике, тем не менее, в литературе описаны случаи, в которых бактерия являлась причиной инфицирования эндокардита (Omote, et al, 2006).
Цель исследования
Подтвердить эффективность использование метода MALDI-TOF масс-спектрометрии для идентификации Pseudomonas aeruginosa и Pseudomonas mendocina и метода молекулярной генетики (классической ПЦР) для обнаружения генов патогенности.
Задачи исследования
1. Выделение чистой культуры НФГОБ;
2. Проведение идентификации методом MALDI-TOF масс-
спектрометрии;
3. Подбор видоспецифичных олигонуклеотидных праймеров;
4. Проведение ПЦР анализа стандартным методом с последующей детекцией результатов;
5. Оценка диагностической ценности исследования.
Научная новизна и теоретическая ценность работы
Впервые для определения этиологической значимости возбудителя заболевания был объединен метод ускоренной идентификации методом MALDI-TOF масс-спектрометрии и определение факторов патогенности микроорганизма молекулярно-генетическим методом с использованием видоспецифичных праймеров.
Научно-практическая значимость
Внедрение результатов исследования в клиническую практику позволит врачам не только ставить точный диагноз, но и предотвращать возможные осложнения различных заболеваний, вызванных неферментирующими грамотрицательными микроорганизмами.
Идентификация возбудителей бактериальных инфекций, вызванных НФГОБ, методом MALDI-TOF масс-спектрометрии и обнаружение патогенных генов НФГОБ молекулярно-генетическим методом ПЦР может стать основой для ранней диагностики, назначения адекватной антибиотикотерапии, мониторинга и прогнозирования течения бактериальных инфекций.
Pseudomonas aeruginosa и Pseudomonas mendocina - условно-патогенные микроорганизмы, относящиеся к группе неферментирующих грамотрицательных бактерий. Частота выделения P. aeruginosa среди неферментирующих бактерий в лечебных учреждениях составляет в среднем 13,4% (Бисенова и др., 2016). P. mendocina, в свою очередь, редко встречается в медицинской практике, тем не менее, в литературе описаны случаи, в которых бактерия являлась причиной инфицирования эндокардита (Nseir et al, 2011). Стоит отметить, что представители рода Pseudomonas с высокой долей вероятности выявляются в клиническом материале от больных с внутрибольничной инфекцией, что обусловлено физиологической устойчивостью возбудителей.
Ранней диагностике и своевременному назначению адекватной антибиотикотерапии препятствует сложность идентификации
микроорганизмов группы НФГОБ. Учитывая тот факт, что бактерии Pseudomonas aeruginosa и Pseudomonas mendocina могут присутствовать у здорового человека не вызывая заболевания, необходимо не только идентифицировать возбудителя в клиническом материале, но и оценить его вирулентность. Вместо рутинного метода бактериологического посева на питательные среды, для идентификации бактерий рода Pseudomonas был использован метод MALDI-TOF масс-спектрометрии. В качестве оценки вирулентности возбудителей был использован метод классической ПЦР, позволяющий обнаружить в геноме бактерий нуклеотидные
последовательности, кодирующие патогенные для микроорганизма токсины.
За 2017 год в бактериологической лаборатории Клиники БГМУ выделено 16880 клинических штаммов микроорганизмов, из которых неферментирующие грамотрицательные микроорганизмы составили 366 штаммов (2,1%).
Бактериологический посев исследуемого клинического материала (мокрота, моча, раневое отделяемое) осуществлялся на первичные, элективные и дифференциально-диагностические среды с целью последующего выделения чистой культуры возбудителя. По рекомендации производителя Vitek MS («BioMerieux», Франция), для идентификации микроорганизмов на масс-спектрометре Vitek MS (MALDI-TOF) («BioMerieux», Франция) предварительно были выделены чистые культуры Pseudomonas aeruginosa (152 клинических штамма) и Pseudomonas mendocina (6 клинических штамма) из каждого образца клинического материала на 5% кровяном агаре и мясо-пептонном агаре.
В результате идентификации выделенных чистых культур микроорганизмов методом MALDI-TOF масс-спектрометрии на автоматическом анализаторе Vitek MS («BioMerieux», Франция) была определена принадлежность 152 штамма (0,9%) к Pseudomonas aeruginosa и 6 (0,03%) штаммов к Pseudomonas mendocina. Для дальнейших исследований было отобрано 37 штаммов Pseudomonas aeruginosa и 6 штаммов Pseudomonas mendocina.
Определение антибиотикочувствительности идентифицируемых культур проводили на автоматическом бактериологическом анализаторе Vitek 2 Compact («BioMerieux», Франция). Штаммы P. aeruginosa чувствительны к следующим антибактериальным препаратам: цефепим (95% устойчивых штамов)> цефоперазон (94%)> цефотаксим (87%)> цефтазидим (86%)> пиперациллин (76%)> амикацин (51%)> тобрамицин (48%)> полимиксин (5%). Исследование антибиотикорезистентности Pseudomonas mendocina показало, что бактерии относительно восприимчивы к ампициллину и цефалоспоринам первого поколения, и абсолютно чувствительны к цефалоспоринам третьего поколения (цефотаксим, цефотаксим, цефтриаксон, цефоперазон, цефтизоксим).
Для проведения молекулярно-генетической идентификации проводился поиск генов патогенности и сравнительный анализ последовательностей ДНК-мишеней НФГОБ в международном банке нуклеотидных последовательностей GenBank. В качестве гена патогенности Pseudomonas aeruginosa был выбран ген toxA, отвечающий за синтез экзотоксина патогенной бактерии. По литературным данным, более 80% клинических изолятов P. aeruginosa продуцируют экзотоксин А и до 27% штаммов, выделенных из окружающей среды (Diaz et а1, 2011). Цитотоксическое действие экзотоксина А заключается в подавлении синтеза белка в чувствительных клетках. У пациентов, которые были инфицированы Pseudomonas aeruginosa, выявляют в сыворотке крови высокие титры антител против экзотоксина А (Sato, Frank, 2011). Исходя из этого можно сделать вывод, что экзотоксину А условно-патогенной палочки отведена ключевая роль в определении этиологии возбудителя.
По литературным данным, Pseudomonas mendocina обладает менее выраженной вирулентностью, по сравнению с P. aeruginosa (Suel et Я1, 2011). Этиологическая значимость бактерий во многом определяется узким спектром продуцируемых патогенных для макроорганизма токсинов. Детекция продуктов амплификации P. mendocina с праймером PsAerug21 к гену toxA выявила отрицательный результат. Исходя из чего можно сделать вывод, что клинические штаммы условно-патогенной бактерии с высокой долей вероятности не продуцируют экзотоксин А. В качестве патогенных белков, определяющих вирулентность бактерии, были выбраны интегральные белки семейства MviN (ген pmen 4277). По литературным данным, белки семейства MviN выступают у некоторых бактерий в качестве фактора, ответственного за переход липида II через цитоплазматическую мембрану (Tyler et al, 2010).
Подбор олигонуклеотидных праймеров PsAerug21 и PsMen22 к специфическим консервативным последовательностям ДНК-мишеней (соответственно, ген toxA экзотоксина Pseudomonas aeruginosa и ген pmen 4277 Pseudomonas mendocina) был проведен с помощью пакета программ DNАStar.
Проверка подобранных праймеров на специфичность и чувствительность к определенной последовательности ДНК в геноме исследуемых микроорганизмов выполнялась с помощью ПЦР на музейных культурах Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Escherichia coli ATCC 25922.
Методом молекулярной генетики (классическая ПЦР) ген toxA экзотоксина Pseudomonas aeruginosa был обнаружен в 32 образцах (85,6%), гена pmen_4277 семейства белков MVIN Pseudomonas mendocina в 5 образцах (83,3%). Среди штаммов, выделенных от больных, с высокой долей вероятности (83-85%) выявляются именно штаммы, имеющие в своем геноме нуклеотидные последовательности, кодирующие синтез токсичных белки (экзотоксин А у Pseudomonas aeruginosa и белки семейства MVIN у Pseudomonas mendocina}. Исходя из чего можно сделать вывод, что степень вирулентности исследуемых бактерий во многом определяется продуцируемыми токсинами.
Сопоставление результатов идентификации Pseudomonas aeruginosa методом MALDI-TOF и обнаружения патогенного гена toxA методом классической ПЦР статистически не значимо (ф крит. = 0.02706, p <0,05); связь между факторным и результативным признаками статистически значима (р = 0.302, р <0.05).
Сопоставление результатов идентификации Pseudomonas mendocina методом MALDI-TOF и обнаружения патогенного гена pmen 4277 статистически значимо (ф крит. = 0.50000, p <0,05); связь между
факторным и результативным признаками статистически не значима (р = 0.297, р <0.05).
Ранней диагностике и своевременному назначению адекватной антибиотикотерапии препятствует сложность идентификации
микроорганизмов группы НФГОБ. Учитывая тот факт, что бактерии Pseudomonas aeruginosa и Pseudomonas mendocina могут присутствовать у здорового человека не вызывая заболевания, необходимо не только идентифицировать возбудителя в клиническом материале, но и оценить его вирулентность. Вместо рутинного метода бактериологического посева на питательные среды, для идентификации бактерий рода Pseudomonas был использован метод MALDI-TOF масс-спектрометрии. В качестве оценки вирулентности возбудителей был использован метод классической ПЦР, позволяющий обнаружить в геноме бактерий нуклеотидные
последовательности, кодирующие патогенные для микроорганизма токсины.
За 2017 год в бактериологической лаборатории Клиники БГМУ выделено 16880 клинических штаммов микроорганизмов, из которых неферментирующие грамотрицательные микроорганизмы составили 366 штаммов (2,1%).
Бактериологический посев исследуемого клинического материала (мокрота, моча, раневое отделяемое) осуществлялся на первичные, элективные и дифференциально-диагностические среды с целью последующего выделения чистой культуры возбудителя. По рекомендации производителя Vitek MS («BioMerieux», Франция), для идентификации микроорганизмов на масс-спектрометре Vitek MS (MALDI-TOF) («BioMerieux», Франция) предварительно были выделены чистые культуры Pseudomonas aeruginosa (152 клинических штамма) и Pseudomonas mendocina (6 клинических штамма) из каждого образца клинического материала на 5% кровяном агаре и мясо-пептонном агаре.
В результате идентификации выделенных чистых культур микроорганизмов методом MALDI-TOF масс-спектрометрии на автоматическом анализаторе Vitek MS («BioMerieux», Франция) была определена принадлежность 152 штамма (0,9%) к Pseudomonas aeruginosa и 6 (0,03%) штаммов к Pseudomonas mendocina. Для дальнейших исследований было отобрано 37 штаммов Pseudomonas aeruginosa и 6 штаммов Pseudomonas mendocina.
Определение антибиотикочувствительности идентифицируемых культур проводили на автоматическом бактериологическом анализаторе Vitek 2 Compact («BioMerieux», Франция). Штаммы P. aeruginosa чувствительны к следующим антибактериальным препаратам: цефепим (95% устойчивых штамов)> цефоперазон (94%)> цефотаксим (87%)> цефтазидим (86%)> пиперациллин (76%)> амикацин (51%)> тобрамицин (48%)> полимиксин (5%). Исследование антибиотикорезистентности Pseudomonas mendocina показало, что бактерии относительно восприимчивы к ампициллину и цефалоспоринам первого поколения, и абсолютно чувствительны к цефалоспоринам третьего поколения (цефотаксим, цефотаксим, цефтриаксон, цефоперазон, цефтизоксим).
Для проведения молекулярно-генетической идентификации проводился поиск генов патогенности и сравнительный анализ последовательностей ДНК-мишеней НФГОБ в международном банке нуклеотидных последовательностей GenBank. В качестве гена патогенности Pseudomonas aeruginosa был выбран ген toxA, отвечающий за синтез экзотоксина патогенной бактерии. По литературным данным, более 80% клинических изолятов P. aeruginosa продуцируют экзотоксин А и до 27% штаммов, выделенных из окружающей среды (Diaz et а1, 2011). Цитотоксическое действие экзотоксина А заключается в подавлении синтеза белка в чувствительных клетках. У пациентов, которые были инфицированы Pseudomonas aeruginosa, выявляют в сыворотке крови высокие титры антител против экзотоксина А (Sato, Frank, 2011). Исходя из этого можно сделать вывод, что экзотоксину А условно-патогенной палочки отведена ключевая роль в определении этиологии возбудителя.
По литературным данным, Pseudomonas mendocina обладает менее выраженной вирулентностью, по сравнению с P. aeruginosa (Suel et Я1, 2011). Этиологическая значимость бактерий во многом определяется узким спектром продуцируемых патогенных для макроорганизма токсинов. Детекция продуктов амплификации P. mendocina с праймером PsAerug21 к гену toxA выявила отрицательный результат. Исходя из чего можно сделать вывод, что клинические штаммы условно-патогенной бактерии с высокой долей вероятности не продуцируют экзотоксин А. В качестве патогенных белков, определяющих вирулентность бактерии, были выбраны интегральные белки семейства MviN (ген pmen 4277). По литературным данным, белки семейства MviN выступают у некоторых бактерий в качестве фактора, ответственного за переход липида II через цитоплазматическую мембрану (Tyler et al, 2010).
Подбор олигонуклеотидных праймеров PsAerug21 и PsMen22 к специфическим консервативным последовательностям ДНК-мишеней (соответственно, ген toxA экзотоксина Pseudomonas aeruginosa и ген pmen 4277 Pseudomonas mendocina) был проведен с помощью пакета программ DNАStar.
Проверка подобранных праймеров на специфичность и чувствительность к определенной последовательности ДНК в геноме исследуемых микроорганизмов выполнялась с помощью ПЦР на музейных культурах Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Escherichia coli ATCC 25922.
Методом молекулярной генетики (классическая ПЦР) ген toxA экзотоксина Pseudomonas aeruginosa был обнаружен в 32 образцах (85,6%), гена pmen_4277 семейства белков MVIN Pseudomonas mendocina в 5 образцах (83,3%). Среди штаммов, выделенных от больных, с высокой долей вероятности (83-85%) выявляются именно штаммы, имеющие в своем геноме нуклеотидные последовательности, кодирующие синтез токсичных белки (экзотоксин А у Pseudomonas aeruginosa и белки семейства MVIN у Pseudomonas mendocina}. Исходя из чего можно сделать вывод, что степень вирулентности исследуемых бактерий во многом определяется продуцируемыми токсинами.
Сопоставление результатов идентификации Pseudomonas aeruginosa методом MALDI-TOF и обнаружения патогенного гена toxA методом классической ПЦР статистически не значимо (ф крит. = 0.02706, p <0,05); связь между факторным и результативным признаками статистически значима (р = 0.302, р <0.05).
Сопоставление результатов идентификации Pseudomonas mendocina методом MALDI-TOF и обнаружения патогенного гена pmen 4277 статистически значимо (ф крит. = 0.50000, p <0,05); связь между
факторным и результативным признаками статистически не значима (р = 0.297, р <0.05).
