МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДЕТЕКЦИЯ ФРАГМЕНТОВ ДНК ГЕНА КОЛИБАКТИНА ESCHERICHIA COLI ПРИ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ КИШЕЧНИКА
|
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Современные представления о роли кишечной микрофлоры в развитии заболеваний
1.2 Нарушение микробиоты желудочно-кишечного тракта у больных
1.3 Общая характеристика E.Coli
1.4 Эпидемиология эшерихий
1.5 Болезнь Крона и адгезивно-инвазивные E.coli
1.6 Г енотоксины E.col i
1.7 Маркеры кишечного воспаления при заболеваниях кишечника
1.8 Лабораторные методы исследования
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Выделение препаратов ДНК из клинического материала
2.2. Выделение ДНК из биоптатов оптимизированным методом
2.3 Подбор и синтез специфических олигонуклеотидных праймеров
2.4 Проведение ПЦР - анализа препаратов ДНК E.coli на выявление гена колибактина
2.5 Электрофоретическое разделение ПЦР продуктов препаратов ДНК в агарозном геле
ГЛАВА 3.РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
3.1 Подбор оптимальных праймеров для ПЦР-идентификации E.coli гена колибактина
3.2 Анализ обнаружения гена колибактина в E.coli исследуемом
клиническом материале
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЯ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Современные представления о роли кишечной микрофлоры в развитии заболеваний
1.2 Нарушение микробиоты желудочно-кишечного тракта у больных
1.3 Общая характеристика E.Coli
1.4 Эпидемиология эшерихий
1.5 Болезнь Крона и адгезивно-инвазивные E.coli
1.6 Г енотоксины E.col i
1.7 Маркеры кишечного воспаления при заболеваниях кишечника
1.8 Лабораторные методы исследования
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Выделение препаратов ДНК из клинического материала
2.2. Выделение ДНК из биоптатов оптимизированным методом
2.3 Подбор и синтез специфических олигонуклеотидных праймеров
2.4 Проведение ПЦР - анализа препаратов ДНК E.coli на выявление гена колибактина
2.5 Электрофоретическое разделение ПЦР продуктов препаратов ДНК в агарозном геле
ГЛАВА 3.РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
3.1 Подбор оптимальных праймеров для ПЦР-идентификации E.coli гена колибактина
3.2 Анализ обнаружения гена колибактина в E.coli исследуемом
клиническом материале
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЯ
Актуальность проблемы
Во всем мире в практической гастроэнтерологии одной наиболее распространенной и острой проблемой являются воспалительные заболевания кишечника (ВЗК). К этой группе относятся болезнь Крона (БК) и язвенный колит (ЯК), которые характеризуются хроническим воспалением, рецидивирующим в кишечнике у генетически предрасположенных лиц и подвергается воздействию определенных экологических факторов. В связи с отсутствием единой точки зрения на проблему ВЗК, в последние годы заметен рост количества больных не только с тяжелыми формами ВЗК (Дорофеев А.Э., 2010), доброкачественными опухолями, но и колоректальным раком (КРР) (Wong J.J., 2007).
Кишечная микрофлора человека состоит из 100 трлн микроорганизмов, относящихся к 36 000 видов. Микробиоценоз желудочно-кишечного тракта участвует в поддержании, как местного, так и системного гомеостаза хозяина- макроорганизма, но при нарушении жизнедеятельности кишечной флоры рост развития различных патологий к системе организма возрастает. Известно, что в 66-93% случаев ВЗК сопутствует дисбиоз кишечника [Халиф И.Л., 2004]. При этом влияние токсинов энтерогенных штаммов могут способствовать возрастанию синтеза провоспалительных цитокинов. Тем самым эти вещества оказывают влияние на межклеточное взаимодействие и внутриклеточную передачу, что провоцируют появление мутаций.
Одной из таких бактерий является Escherichia coli. Она синтезирует бактериальный токсин - колибактин, индуцирующий разрывы в ДНК, и приводящий к онкогенным мутациям (Nougayrede J.P., 2006). А также из семейства Enterobacteriaceae представителями носителя колибактина являются Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes и Citrobacter koseri (Putze J., et al., 2009).
Функциональная связь между дисбалансом микроорганизмов, заселяющих кишечник, и канцерогенезом при хроническом воспалении предоставляет возможность улучшить понимание в молекулярных механизмах участия бактерий в онкогенезе. Возможно, бактерии являются объектом для скрининга предрасположенности и предотвращения рака человека (Arthur J.C. et al.,2012). Несмотря на то, что современная медицина имеет значительные достижения, этиология и патогенез ВЗК до конца не изучены. Представления о механизмах воспалительного процесса в кишечнике, а также защитных механизмах также плохо изучены. В связи с этим, проблема ВЗК становится все более актуальным и требует дальнейшего исследования.
Цель работы
Молекулярная - генетическая детекция и оценка частоты встречаемости фрагментов гена колибактина Escherichia coli при воспалительных заболеваниях кишечника.
Задачи исследования
1. Сбор клинического материала.
2. Выделение бактериальной ДНК из собранного клинического
материала больных.
3. Подбор праймеров для выявления генетических детерминант pks острова патогенности, содержащего гены clb (colibactin).
4. ПЦР - анализ образцов ДНК, выделенных из фекального материала больных среднетяжелыми формами острой кишечной инфекции и биоптатов.
Практическая значимость. Предложенный подход позволит разработать оптимальный метод и наборы реагентов для пробоподготовки и ПЦР обнаружения непосредственно в материале больных с воспалительными заболеваниями кишечника.
Область применения результатов исследования.
Детекция генетических детерминант pks острова патогенности, содержащего гены clb (colibactin) бактерии Escherichia coli может стать основой при постановке диагноза и дальнейшего этиотропного лечения больных. Результаты проделанной работы могут быть применимы в медицине, лабораторной диагностике и при назначении лекарственных препаратов против них.
Во всем мире в практической гастроэнтерологии одной наиболее распространенной и острой проблемой являются воспалительные заболевания кишечника (ВЗК). К этой группе относятся болезнь Крона (БК) и язвенный колит (ЯК), которые характеризуются хроническим воспалением, рецидивирующим в кишечнике у генетически предрасположенных лиц и подвергается воздействию определенных экологических факторов. В связи с отсутствием единой точки зрения на проблему ВЗК, в последние годы заметен рост количества больных не только с тяжелыми формами ВЗК (Дорофеев А.Э., 2010), доброкачественными опухолями, но и колоректальным раком (КРР) (Wong J.J., 2007).
Кишечная микрофлора человека состоит из 100 трлн микроорганизмов, относящихся к 36 000 видов. Микробиоценоз желудочно-кишечного тракта участвует в поддержании, как местного, так и системного гомеостаза хозяина- макроорганизма, но при нарушении жизнедеятельности кишечной флоры рост развития различных патологий к системе организма возрастает. Известно, что в 66-93% случаев ВЗК сопутствует дисбиоз кишечника [Халиф И.Л., 2004]. При этом влияние токсинов энтерогенных штаммов могут способствовать возрастанию синтеза провоспалительных цитокинов. Тем самым эти вещества оказывают влияние на межклеточное взаимодействие и внутриклеточную передачу, что провоцируют появление мутаций.
Одной из таких бактерий является Escherichia coli. Она синтезирует бактериальный токсин - колибактин, индуцирующий разрывы в ДНК, и приводящий к онкогенным мутациям (Nougayrede J.P., 2006). А также из семейства Enterobacteriaceae представителями носителя колибактина являются Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes и Citrobacter koseri (Putze J., et al., 2009).
Функциональная связь между дисбалансом микроорганизмов, заселяющих кишечник, и канцерогенезом при хроническом воспалении предоставляет возможность улучшить понимание в молекулярных механизмах участия бактерий в онкогенезе. Возможно, бактерии являются объектом для скрининга предрасположенности и предотвращения рака человека (Arthur J.C. et al.,2012). Несмотря на то, что современная медицина имеет значительные достижения, этиология и патогенез ВЗК до конца не изучены. Представления о механизмах воспалительного процесса в кишечнике, а также защитных механизмах также плохо изучены. В связи с этим, проблема ВЗК становится все более актуальным и требует дальнейшего исследования.
Цель работы
Молекулярная - генетическая детекция и оценка частоты встречаемости фрагментов гена колибактина Escherichia coli при воспалительных заболеваниях кишечника.
Задачи исследования
1. Сбор клинического материала.
2. Выделение бактериальной ДНК из собранного клинического
материала больных.
3. Подбор праймеров для выявления генетических детерминант pks острова патогенности, содержащего гены clb (colibactin).
4. ПЦР - анализ образцов ДНК, выделенных из фекального материала больных среднетяжелыми формами острой кишечной инфекции и биоптатов.
Практическая значимость. Предложенный подход позволит разработать оптимальный метод и наборы реагентов для пробоподготовки и ПЦР обнаружения непосредственно в материале больных с воспалительными заболеваниями кишечника.
Область применения результатов исследования.
Детекция генетических детерминант pks острова патогенности, содержащего гены clb (colibactin) бактерии Escherichia coli может стать основой при постановке диагноза и дальнейшего этиотропного лечения больных. Результаты проделанной работы могут быть применимы в медицине, лабораторной диагностике и при назначении лекарственных препаратов против них.
Изучение генома кишечной палочки вызывает большой интерес у исследователей, главным образом, в связи с тем что, имеющиеся острова генотоксичности pks у E.coli могут синтезировать ген колибактин, который обладает канцерогенными свойствами и может вызывать рак толстой кишки.
До 90% в человеческой популяции колонизирует кишечная палочка, она остается преобладающим аэробным организмом в кишечнике. E. coli достигла плотности выше 109 КОЕ на грамм фекалий. После 2 лет жизни популяция E.coli стабилизируется примерно в 107-108 КОЕ в толстой кишке и в меньшей степени подвздошной кишке (103-105 КОЕ) до постепенного снижения у пожилых людей. Помимо этих безвредных штаммов комменсалов, семейство E. coli также содержит высоко патогенные (например, IPEC, кишечные патогенные E. coli) и экстраинтестинальные патогенные (например, exPEC, экстра-кишечные патогенные штаммы E.coli), ответственные за смерть более чем 2 миллионов людей в год. Колибактин является тонкой гранью между комменсалами и патогенными видами. Геном ядра кишечной палочки был обогащен благодаря многочисленным мобильным генетическим элементам и включал в себя плазмиды, фаги, геномные острова. Анализ генов, присутствующих в ядре-геноме, выявил пять основных филогенетических групп, классифицированных как A, B1, B2, D и E. В то время как группа А включает в основном непатогенные штаммы, группа В2 включает как условно - патогенные, так и патогенные штаммы. Группа В2 рано появилась в филогенетическом дереве E. coli ,до 30% штаммов группы B2 переносят в своем геноме кластер pks-гена.
В виду этого, в рамках данной работы мы изучали процессы образования токсинов E.coli и воздействия токсических продуктов на организм, так как путем идентификации и изучения бактериальных генов, возможно, разработать раннюю диагностику рака толстой кишки и соответствующую антибактериальную терапию.
В нашем исследовании мы рассмотрели несколько факторов генетической регуляции гена колибактина. Также был произведен подбор специфичных праймеров, с помощью которых была проведена амплификации ДНК гена колибактина. Были получены отрицательные результаты. Проанализировав отрицательные результаты выделены несколько причин:
1. Низкая распространенность штаммов группы B2 E.coli.
2. Чрезмерная концентрация сопутствующей флоры и наличие различных метаболитов в биоматериале (кал).
3. Условия хранения и обработки биоматериала (биоптат).
4. Ингибирование ПЦР.
Островки патогенности pks, ответственные за синтез колибактина были обнаружены не только в кишечной палочки, но ив Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes и изолятов Citrobacter koseri.(Johannes Putze et al.,2009) Обнаружение генов колибактина связанный с горизонтальным переносом в нескольких энтеробактериях, дает новое представление о распространении этого гена кластера и его предполагаемого способа передачи. Что позволяет расширить исследования этого гена, обнаруженные у других видов бактерий.
До 90% в человеческой популяции колонизирует кишечная палочка, она остается преобладающим аэробным организмом в кишечнике. E. coli достигла плотности выше 109 КОЕ на грамм фекалий. После 2 лет жизни популяция E.coli стабилизируется примерно в 107-108 КОЕ в толстой кишке и в меньшей степени подвздошной кишке (103-105 КОЕ) до постепенного снижения у пожилых людей. Помимо этих безвредных штаммов комменсалов, семейство E. coli также содержит высоко патогенные (например, IPEC, кишечные патогенные E. coli) и экстраинтестинальные патогенные (например, exPEC, экстра-кишечные патогенные штаммы E.coli), ответственные за смерть более чем 2 миллионов людей в год. Колибактин является тонкой гранью между комменсалами и патогенными видами. Геном ядра кишечной палочки был обогащен благодаря многочисленным мобильным генетическим элементам и включал в себя плазмиды, фаги, геномные острова. Анализ генов, присутствующих в ядре-геноме, выявил пять основных филогенетических групп, классифицированных как A, B1, B2, D и E. В то время как группа А включает в основном непатогенные штаммы, группа В2 включает как условно - патогенные, так и патогенные штаммы. Группа В2 рано появилась в филогенетическом дереве E. coli ,до 30% штаммов группы B2 переносят в своем геноме кластер pks-гена.
В виду этого, в рамках данной работы мы изучали процессы образования токсинов E.coli и воздействия токсических продуктов на организм, так как путем идентификации и изучения бактериальных генов, возможно, разработать раннюю диагностику рака толстой кишки и соответствующую антибактериальную терапию.
В нашем исследовании мы рассмотрели несколько факторов генетической регуляции гена колибактина. Также был произведен подбор специфичных праймеров, с помощью которых была проведена амплификации ДНК гена колибактина. Были получены отрицательные результаты. Проанализировав отрицательные результаты выделены несколько причин:
1. Низкая распространенность штаммов группы B2 E.coli.
2. Чрезмерная концентрация сопутствующей флоры и наличие различных метаболитов в биоматериале (кал).
3. Условия хранения и обработки биоматериала (биоптат).
4. Ингибирование ПЦР.
Островки патогенности pks, ответственные за синтез колибактина были обнаружены не только в кишечной палочки, но ив Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes и изолятов Citrobacter koseri.(Johannes Putze et al.,2009) Обнаружение генов колибактина связанный с горизонтальным переносом в нескольких энтеробактериях, дает новое представление о распространении этого гена кластера и его предполагаемого способа передачи. Что позволяет расширить исследования этого гена, обнаруженные у других видов бактерий.
Подобные работы
- МОЛЕКУЛЯРНО- ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДЕТЕКЦИЯ ФРАГМЕНТОВ ДНК ОСТРОВА ГЕНОТОКСИЧНОСТИ (pks) ESCHERICHIA COLI NC101 В БИОПТАТАХ ПРИ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ КИШЕЧНИКА.
Дипломные работы, ВКР, биология. Язык работы: Русский. Цена: 4540 р. Год сдачи: 2018