СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ИНФОРМАТИВНОСТИ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ И MALDI-TOF МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ ПРИ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДОВ LACTOBACILLUS И BIFIDOBACTERIUM
|
Список сокращений и условных обозначений 3
ВВЕДЕНИЕ 4
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. Lactobacillus 8
1.2. Bifidobacterium 15
1.3. Полимеразная цепная реакция 19
1.4. Масс-спектрометрия MALDI-TOF 30
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 37
2.1. Бактериальные штаммы 37
2.2. Питательные среды и культивирование 44
2.2.1. Посев Lactobacillus 44
2.2.2. Посев Bifidobacterium 45
2.2.3. Создание анаэробных условий 48
2.3. Определение фенотипических признаков 48
2.3.1. Окраска по Граму 48
2.3.1. Биохимические тесты 50
2.4. ПЦР- анализ 55
2.5. MALDI-TOF масс-спектрометрический анализ 58
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 61
3.1. Идентификация видов Lactobacillus spp. и Bifidobacterium
spp. традиционными биохимическими методами 61
3.2. Идентификация Lactobacillus spp. и Bifidobacterium spp.
с помощью ПЦР-анализа 73
3.3. Идентификация Lactobacillus spp. и Bifidobacterium spp.
методом MALDI-TOF масс-спектрометрического анализа 76
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 80
ВЫВОДЫ 84
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 85
ПРИЛОЖЕНИЕ 94
ВВЕДЕНИЕ 4
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. Lactobacillus 8
1.2. Bifidobacterium 15
1.3. Полимеразная цепная реакция 19
1.4. Масс-спектрометрия MALDI-TOF 30
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 37
2.1. Бактериальные штаммы 37
2.2. Питательные среды и культивирование 44
2.2.1. Посев Lactobacillus 44
2.2.2. Посев Bifidobacterium 45
2.2.3. Создание анаэробных условий 48
2.3. Определение фенотипических признаков 48
2.3.1. Окраска по Граму 48
2.3.1. Биохимические тесты 50
2.4. ПЦР- анализ 55
2.5. MALDI-TOF масс-спектрометрический анализ 58
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 61
3.1. Идентификация видов Lactobacillus spp. и Bifidobacterium
spp. традиционными биохимическими методами 61
3.2. Идентификация Lactobacillus spp. и Bifidobacterium spp.
с помощью ПЦР-анализа 73
3.3. Идентификация Lactobacillus spp. и Bifidobacterium spp.
методом MALDI-TOF масс-спектрометрического анализа 76
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 80
ВЫВОДЫ 84
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 85
ПРИЛОЖЕНИЕ 94
Актуальность проблемы
Актуальным вопросом в микробиологии на сегодняшний день является поиск новых штаммов бактерий рода Lactobacillus и Bifidobacterium для создания современных пробиотических препаратов и продуктов функционального питания, что обусловлено широчайшим спектром полезных свойств этих микроорганизмов. Поэтому быстрая и точная идентификация данных микроорганизмов является востребованной задачей как научного, так и прикладного характера [Салгина А.В., Бондаренко Т.А., 2014].
Представители родов Lactobacillus и Bifidobacterium являются компонентами естественной микрофлорой организма человека и играют важную роль в поддержании здоровья: обеспечивают защиту эпителиальных клеток от повреждения, регуляцию липидного обмена, стимуляцию кишечного ангиогенеза, а также выполняют антитоксическую функцию, поддерживают оптимальный уровень метаболических и ферментативных процессов, иммунного статуса, антимутагенной и антиканцерогенной активности [Бондаренко В.М., 2005].
Различные виды и штаммы Lactobacillus и Bifidobacterium широко используются в составе лекарств, в том числе пробиотиков, для лечения дисбактериозов разной этиологии, заболеваний полости рта, урогенитальной сферы, желудочно-кишечных расстройств, а также в составе БАДов. Пробиотические продукты оказывают благоприятное влияние на физиологические функции и биохимические реакции организма человека и животных. Их употребление способствует улучшению и нормализации различных функций и проявлению собственных защитных ресурсов организма.
До недавнего времени идентификация и подтверждение видовой принадлежности Lactobacillus и Bifidobacterium осуществлялась на основе изучения морфологических, физиологических и биохимических признаков, что не всегда эффективно, особенно при работе со смешанными культурами.
Такой подход ограничивает возможности проведения качественного и количественного анализа видового состава лакто- и бифидофлоры и не всегда позволяет эффективно отбирать безопасные и технологичные штаммы этих бактерий для использования их в качестве заквасочных культур в производстве кисломолочных продуктов и пробиотических препаратов [Кузнецова Т.В. и др., 2016].
На сегодняшний день одним из наиболее перспективных методов идентификации штаммов Lactobacillus и Bifidobacterium является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Одновременное применение нескольких методов ПЦР обеспечивает возможность генотипирования Lactobacillus и Bifidobacterium и позволяет решать задачи дифференциации видов и штаммов, входящих в состав пробиотических и производственных заквасок [Кузнецова Т.В. и др., 2016].
Также, в настоящее время, на замену традиционным методам идентификации микроорганизмов приходят экспресс-методы, основанные на физико-химических методах анализа состава микробной клетки и продуктов ее метаболизма. Таким методом является метод матрично-ассоциированной десорбции/ионизации (МАЛДИ), который в комплексе с времяпролетной масс-спектрометрией позволяет проводить анализ сложных биоорганических молекул, в частности тяжелых, труднолетучих молекул нуклеиновых кислот и белков [Салгина А.В. и др., 2014].
Метод MALDI TOF масс-спектрометрии позволяет не только идентифицировать микроорганизм, но и в ряде случаев получать уникальный набор рибосомальных белков (фингерпринт) для каждого из исследуемых штаммов, что открывает широкие возможности и перспективы для изучения штаммовых характеристик [Точилина А.Г., Белова И.В., 2015].
Таким образом, в связи с возникновением современных, более точных методов идентификации микроорганизмов, таких как ПЦР и MALDI TOF масс-спектрометрия, возникла необходимость установить информативность этих методов и провести их сравнительную оценку.
Цель исследования
Сравнительная оценка информативности полимеразной цепной реакции и MALDI-TOF масс-спектрометрии при идентификации представителей родов Lactobacillus и Bifidobacterium для разработки новых алгоритмов, позволяющих значительно сократить продолжительность исследования и оптимизировать процесс формирования коллекций, представляющих интерес для медицины и пищевой промышленности.
Задачи исследования
1. Получение чистых культур штаммов представителей родов Lactobacillus и Bifidobacterium;
2. Оценка эффективности использования родо- и видоспецифических праймеров для ПЦР-детекции и идентификации Lactobacillus и Bifidobacterium;
3. Определение масс-спектров и анализ результативности MALDI-TOF масс-спектрометрического анализа для идентификации близкородственных видов родов Lactobacillus и Bifidobacterium;
4. Сравнительная оценка эффективности биохимического метода, ПЦР- анализа и масс-спектрометрии для дифференциации представителей родов Lactobacillus и Bifidobacterium.
Научная новизна
Показано, что классические бактериологические методы в связи с вариабельностью признаков и большим фенотипическим сходством представителей родов Lactobacillus и Bifidobacterium не являются достаточными для их эффективной дифференциации и идентификации, а могут быть использованы только для выделения возбудителя в чистой культуре из исследуемого материала. Поэтому для надежной и эффективной
7
диагностики необходимо использовать традиционные методы в сочетании с
современными молекулярными (MALDI-TOF-MS и ПЦР).
Совокупность методов классической бактериологии, MALDI-TOF-MS анализа и ПЦР позволила выявить микроорганизмы родов Lactobacillus и Bifidobacterium. Метод MALDI-TOF-MS оказался наиболее эффективным и достоверным способом видовой идентификации представителей родов Lactobacillus и Bifidobacterium.
На чистой культуре Lactobacillus- и Bifidobacterium показана высокая специфичность праймеров, используемых для родовой детекции Lactobacillus spp. и Bifidobacterium spp. и межвидовой дифференциации штаммов L. plantarum, L. acidophilus и L. rhamnosus, а также B. bifidum и B. longum, и именно их следует использовать в дальнейшей работе по дифференциальной диагностике Lactobacillus- и Bifidobacterium.
Определены молекулярные маркеры (масс-пики) и проведена межви-довая дифференциация коллекции штаммов L.plantarum, . L.rhamnosus, L.acidophilus, , B.bifidum и B.longum с использованием метода MALDI-TOF.
Охарактеризованы штаммы L. plantarum, L. acidophilus, L. rhamnosus, B. bifidum и B. longum по широкому набору фено- и генотипических признаков.
Практическая значимость
Депонированы штаммы Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rhamnosus, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum в рабочей коллекции кафедры фундаментальной и прикладной микробиологии БГМУ, которые могут быть использованы в качестве тест- штаммов при создании пробиотических препаратов.
Актуальным вопросом в микробиологии на сегодняшний день является поиск новых штаммов бактерий рода Lactobacillus и Bifidobacterium для создания современных пробиотических препаратов и продуктов функционального питания, что обусловлено широчайшим спектром полезных свойств этих микроорганизмов. Поэтому быстрая и точная идентификация данных микроорганизмов является востребованной задачей как научного, так и прикладного характера [Салгина А.В., Бондаренко Т.А., 2014].
Представители родов Lactobacillus и Bifidobacterium являются компонентами естественной микрофлорой организма человека и играют важную роль в поддержании здоровья: обеспечивают защиту эпителиальных клеток от повреждения, регуляцию липидного обмена, стимуляцию кишечного ангиогенеза, а также выполняют антитоксическую функцию, поддерживают оптимальный уровень метаболических и ферментативных процессов, иммунного статуса, антимутагенной и антиканцерогенной активности [Бондаренко В.М., 2005].
Различные виды и штаммы Lactobacillus и Bifidobacterium широко используются в составе лекарств, в том числе пробиотиков, для лечения дисбактериозов разной этиологии, заболеваний полости рта, урогенитальной сферы, желудочно-кишечных расстройств, а также в составе БАДов. Пробиотические продукты оказывают благоприятное влияние на физиологические функции и биохимические реакции организма человека и животных. Их употребление способствует улучшению и нормализации различных функций и проявлению собственных защитных ресурсов организма.
До недавнего времени идентификация и подтверждение видовой принадлежности Lactobacillus и Bifidobacterium осуществлялась на основе изучения морфологических, физиологических и биохимических признаков, что не всегда эффективно, особенно при работе со смешанными культурами.
Такой подход ограничивает возможности проведения качественного и количественного анализа видового состава лакто- и бифидофлоры и не всегда позволяет эффективно отбирать безопасные и технологичные штаммы этих бактерий для использования их в качестве заквасочных культур в производстве кисломолочных продуктов и пробиотических препаратов [Кузнецова Т.В. и др., 2016].
На сегодняшний день одним из наиболее перспективных методов идентификации штаммов Lactobacillus и Bifidobacterium является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Одновременное применение нескольких методов ПЦР обеспечивает возможность генотипирования Lactobacillus и Bifidobacterium и позволяет решать задачи дифференциации видов и штаммов, входящих в состав пробиотических и производственных заквасок [Кузнецова Т.В. и др., 2016].
Также, в настоящее время, на замену традиционным методам идентификации микроорганизмов приходят экспресс-методы, основанные на физико-химических методах анализа состава микробной клетки и продуктов ее метаболизма. Таким методом является метод матрично-ассоциированной десорбции/ионизации (МАЛДИ), который в комплексе с времяпролетной масс-спектрометрией позволяет проводить анализ сложных биоорганических молекул, в частности тяжелых, труднолетучих молекул нуклеиновых кислот и белков [Салгина А.В. и др., 2014].
Метод MALDI TOF масс-спектрометрии позволяет не только идентифицировать микроорганизм, но и в ряде случаев получать уникальный набор рибосомальных белков (фингерпринт) для каждого из исследуемых штаммов, что открывает широкие возможности и перспективы для изучения штаммовых характеристик [Точилина А.Г., Белова И.В., 2015].
Таким образом, в связи с возникновением современных, более точных методов идентификации микроорганизмов, таких как ПЦР и MALDI TOF масс-спектрометрия, возникла необходимость установить информативность этих методов и провести их сравнительную оценку.
Цель исследования
Сравнительная оценка информативности полимеразной цепной реакции и MALDI-TOF масс-спектрометрии при идентификации представителей родов Lactobacillus и Bifidobacterium для разработки новых алгоритмов, позволяющих значительно сократить продолжительность исследования и оптимизировать процесс формирования коллекций, представляющих интерес для медицины и пищевой промышленности.
Задачи исследования
1. Получение чистых культур штаммов представителей родов Lactobacillus и Bifidobacterium;
2. Оценка эффективности использования родо- и видоспецифических праймеров для ПЦР-детекции и идентификации Lactobacillus и Bifidobacterium;
3. Определение масс-спектров и анализ результативности MALDI-TOF масс-спектрометрического анализа для идентификации близкородственных видов родов Lactobacillus и Bifidobacterium;
4. Сравнительная оценка эффективности биохимического метода, ПЦР- анализа и масс-спектрометрии для дифференциации представителей родов Lactobacillus и Bifidobacterium.
Научная новизна
Показано, что классические бактериологические методы в связи с вариабельностью признаков и большим фенотипическим сходством представителей родов Lactobacillus и Bifidobacterium не являются достаточными для их эффективной дифференциации и идентификации, а могут быть использованы только для выделения возбудителя в чистой культуре из исследуемого материала. Поэтому для надежной и эффективной
7
диагностики необходимо использовать традиционные методы в сочетании с
современными молекулярными (MALDI-TOF-MS и ПЦР).
Совокупность методов классической бактериологии, MALDI-TOF-MS анализа и ПЦР позволила выявить микроорганизмы родов Lactobacillus и Bifidobacterium. Метод MALDI-TOF-MS оказался наиболее эффективным и достоверным способом видовой идентификации представителей родов Lactobacillus и Bifidobacterium.
На чистой культуре Lactobacillus- и Bifidobacterium показана высокая специфичность праймеров, используемых для родовой детекции Lactobacillus spp. и Bifidobacterium spp. и межвидовой дифференциации штаммов L. plantarum, L. acidophilus и L. rhamnosus, а также B. bifidum и B. longum, и именно их следует использовать в дальнейшей работе по дифференциальной диагностике Lactobacillus- и Bifidobacterium.
Определены молекулярные маркеры (масс-пики) и проведена межви-довая дифференциация коллекции штаммов L.plantarum, . L.rhamnosus, L.acidophilus, , B.bifidum и B.longum с использованием метода MALDI-TOF.
Охарактеризованы штаммы L. plantarum, L. acidophilus, L. rhamnosus, B. bifidum и B. longum по широкому набору фено- и генотипических признаков.
Практическая значимость
Депонированы штаммы Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rhamnosus, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum в рабочей коллекции кафедры фундаментальной и прикладной микробиологии БГМУ, которые могут быть использованы в качестве тест- штаммов при создании пробиотических препаратов.
Во всем мире для характеристики близкородственных видов родов Lactobacillus и Bifidobacterium используются различные методы. Однако, до настоящего времени не был определен единый стандартизированный подход. Поэтому мы провели сравнительную оценку эффективности биохимического метода, ПЦР-анализа и масс-спектрометрии для дифференциации близкородственных видов. Анализ результативности методов
дифференциации проведен на видах L. plantarum, L. acidophilus, L. rhamnosus, B. bifidum и B. longum (таблица 12 ).
Таким образом, в ходе данной работы проведена сравнительная оценка эффективности методов дифференциации представителей родов Lactobacillus и Bifidobacterium на большой коллекции, различные виды L. plantarum, L. acidophilus, L. rhamnosus, B. bifidum и B. longum. При этом показано, что
81 биохимические тесты не всегда являются достаточными для дифференциации. Фенотипическая идентификация имеет ряд существенных недостатков: субъективность выбора и ограниченность набора изучаемых таксономических признаков и их оценки; высокая изменчивость микроорганизмов; малая информативность (фенотипически проявляется только 5-20 % информации генома); трудоемкость, высокие требования к уровню квалификации персонала, сравнительно низкая стандартизация. В результате по классическим фенотипическим свойствам ошибочно идентифицируется до 30¬50 % культур. Поэтому ручная стандартная фенотипическая идентификация бактерий сложна, продолжительна, ненадежна и не соответствует современным потребностям клинической лаборатории.
Полученные результаты подчеркивают необходимость внедрения молекулярных методов идентификации представителей родов Lactobacillus и Bifidobacterium, что позволит избежать неверных результатов, которые могут возникнуть при исследованиях, основанных на биохимических характеристиках и снизить трудозатраты.
ПЦР имеет несомненные преимущества: прямое определение
возбудителя, высокие специфичность, чувствительность, скорость исследования, универсальность. Однако, при всей доступности и привлекательности, метод полимеразной цепной реакции имеет недостатки: риск контаминации образцов во время пробоподготовки, ведущий к получению ложноположительных результатов; ингибиция реакции гибридизации гепарином; невозможность оценки жизнеспособности обнаруженного микроорганизма. Также метод имеет ограничения и существует вероятность получения ложноотрицательных результатов, так как выявляются только ДНК бактерий, внесенные в методику, подбор праймеров осуществляется к 16S рРНК определенного вида микроорганизма, в то время как даже при наличии праймеров к большому спектру бактерий, ни одна из реакций может не дать положительный результат, а значит эксперимент придется начинать заново. Также следует учитывать, что исследования
82 международного проекта Human microbiome («Микробиом человека») еще не завершены и геном многих возбудителей не секвенирован, а значит не занесены в GenBank.
Современные научные исследования доказали, что состав белков, как и липидов бактериальной клетки, детерминирован генетически, что позволяет использовать их для надежной идентификации микроорганизмов. MALDI-TOF MS идентификация микроорганизмов основана на определении уникального для каждого вида микроорганизмов набора белков - своеобразный «отпечаток пальца» (фингерпринтинг) микроорганизма, «протеомная дактилоскопия». Идентификация осуществляется в основном по рибосомальным белкам, которые присутствуют во всех микроорганизмах.
Преимущества масс-спектрометрического анализа несомненны: позволяет отказаться от длительной, трудоемкой и ненадежной фенотипической идентификации; невысокие требования к квалификации персонала; не требуется специальных расходных материалов; быстрая и простая пробоподготовка; высокая чувствительность - 104-105 клеток -
единичная колония или центрифугат жидкой культуры; высокая скорость идентификации; снижение себестоимости каждого исследования в 12-96 раз в сравнении с фенотипическими методам.
Самое главное достоинство - это возможность видовой идентификации любых видов культивируемых микроорганизмов (нет необходимости заранее предполагать вид выделенной культуры) и высокая точность идентификации до вида, которая превышает 98 %.
Однако, для исследования необходимо предварительно выделить чистую культуру возбудителя, что увеличивает продолжительность исследования. Использование данного метода идентификации при работе со смешанной популяцией микроорганизмов ограничено еще и тем, что после высева пробы жидкой культуры на плотную питательную среду, для установления соотношения бактерий двух разных видов необходимо выделить чистую культуру и исследовать все колонии, выросшие на поверхности среды,
что существенно увеличивает экономические и трудовые затраты. Актуальным вопросом является поиск более эффективного метода для решения поставленной задачи.
Поэтому для видовой идентификации указанных видов целесообразно использовать при оснащении лаборатории необходимым оборудованием методы идентификации, такие как ПЦР-анализ с видоспецифичными праймерами и MALDI-TOF масс-спектрометрия. Внедрение метода масс- спектрометрии в рутинную практику идентификации и дифференциации Lactobacillus и Bifidobacterium требует дополнительных исследований биомаркеров и создание баз данных коллекционных штаммов.
дифференциации проведен на видах L. plantarum, L. acidophilus, L. rhamnosus, B. bifidum и B. longum (таблица 12 ).
Таким образом, в ходе данной работы проведена сравнительная оценка эффективности методов дифференциации представителей родов Lactobacillus и Bifidobacterium на большой коллекции, различные виды L. plantarum, L. acidophilus, L. rhamnosus, B. bifidum и B. longum. При этом показано, что
81 биохимические тесты не всегда являются достаточными для дифференциации. Фенотипическая идентификация имеет ряд существенных недостатков: субъективность выбора и ограниченность набора изучаемых таксономических признаков и их оценки; высокая изменчивость микроорганизмов; малая информативность (фенотипически проявляется только 5-20 % информации генома); трудоемкость, высокие требования к уровню квалификации персонала, сравнительно низкая стандартизация. В результате по классическим фенотипическим свойствам ошибочно идентифицируется до 30¬50 % культур. Поэтому ручная стандартная фенотипическая идентификация бактерий сложна, продолжительна, ненадежна и не соответствует современным потребностям клинической лаборатории.
Полученные результаты подчеркивают необходимость внедрения молекулярных методов идентификации представителей родов Lactobacillus и Bifidobacterium, что позволит избежать неверных результатов, которые могут возникнуть при исследованиях, основанных на биохимических характеристиках и снизить трудозатраты.
ПЦР имеет несомненные преимущества: прямое определение
возбудителя, высокие специфичность, чувствительность, скорость исследования, универсальность. Однако, при всей доступности и привлекательности, метод полимеразной цепной реакции имеет недостатки: риск контаминации образцов во время пробоподготовки, ведущий к получению ложноположительных результатов; ингибиция реакции гибридизации гепарином; невозможность оценки жизнеспособности обнаруженного микроорганизма. Также метод имеет ограничения и существует вероятность получения ложноотрицательных результатов, так как выявляются только ДНК бактерий, внесенные в методику, подбор праймеров осуществляется к 16S рРНК определенного вида микроорганизма, в то время как даже при наличии праймеров к большому спектру бактерий, ни одна из реакций может не дать положительный результат, а значит эксперимент придется начинать заново. Также следует учитывать, что исследования
82 международного проекта Human microbiome («Микробиом человека») еще не завершены и геном многих возбудителей не секвенирован, а значит не занесены в GenBank.
Современные научные исследования доказали, что состав белков, как и липидов бактериальной клетки, детерминирован генетически, что позволяет использовать их для надежной идентификации микроорганизмов. MALDI-TOF MS идентификация микроорганизмов основана на определении уникального для каждого вида микроорганизмов набора белков - своеобразный «отпечаток пальца» (фингерпринтинг) микроорганизма, «протеомная дактилоскопия». Идентификация осуществляется в основном по рибосомальным белкам, которые присутствуют во всех микроорганизмах.
Преимущества масс-спектрометрического анализа несомненны: позволяет отказаться от длительной, трудоемкой и ненадежной фенотипической идентификации; невысокие требования к квалификации персонала; не требуется специальных расходных материалов; быстрая и простая пробоподготовка; высокая чувствительность - 104-105 клеток -
единичная колония или центрифугат жидкой культуры; высокая скорость идентификации; снижение себестоимости каждого исследования в 12-96 раз в сравнении с фенотипическими методам.
Самое главное достоинство - это возможность видовой идентификации любых видов культивируемых микроорганизмов (нет необходимости заранее предполагать вид выделенной культуры) и высокая точность идентификации до вида, которая превышает 98 %.
Однако, для исследования необходимо предварительно выделить чистую культуру возбудителя, что увеличивает продолжительность исследования. Использование данного метода идентификации при работе со смешанной популяцией микроорганизмов ограничено еще и тем, что после высева пробы жидкой культуры на плотную питательную среду, для установления соотношения бактерий двух разных видов необходимо выделить чистую культуру и исследовать все колонии, выросшие на поверхности среды,
что существенно увеличивает экономические и трудовые затраты. Актуальным вопросом является поиск более эффективного метода для решения поставленной задачи.
Поэтому для видовой идентификации указанных видов целесообразно использовать при оснащении лаборатории необходимым оборудованием методы идентификации, такие как ПЦР-анализ с видоспецифичными праймерами и MALDI-TOF масс-спектрометрия. Внедрение метода масс- спектрометрии в рутинную практику идентификации и дифференциации Lactobacillus и Bifidobacterium требует дополнительных исследований биомаркеров и создание баз данных коллекционных штаммов.
