ВВЕДЕНИЕ 4
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1. Краткая историческая справка открытия пробиотиков 7
1.2. Пробиотики 8
1.3. Бактерии Bacillus subtilis 15
1.4. Использвание Bacillus subtilis в качестве пробиотического штамма 17
1.5. Трансформация и естественная компетентность клеток
B.subtilis 21
1.6 Молекулярные векторы 29
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 36
2.1. Выделение и очистка плазмидной ДНК Escherichia coli 36
2.2. Полимеразная цепная реакция 39
2.3. Аналитический гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих
условиях 40
2.4. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами 41
2.5. Лигирование ДНК с помощью ДНК-лигазы фага Т4 42
2.6. Подготовка химически компетентных клеток Escherichia coli 43
2.7. Трансформация компетентных клеток Escherichia coli плазмидной
ДНК 44
2.8. Подготовка компетентных клеток Bacillus subtilis и
трансформация 44
2.9. Микроскопирование 47
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 48
ВЫВОДЫ 55
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 56
ПРИЛОЖЕНИЕ 64
В последние годы отмечается радикальный пересмотр роли микроорганизмов в обеспечении жизнедеятельности человека. Все больше данных за то, чтобы система «микробиота-человек» рассматривалась в качестве новой гармонизированной формы существования живых организмов, именуемой «суперорганизм», поскольку целый ряд описанных для данной системы связей реализуется на метаболическом уровне [Eberl,
2010] . Например, показаны корреляции между изменениями микробиоты кишечника человека, продуктами микробного происхождения и уровнем экспрессии генов, определяющих синтез гормонов в организме хозяина [Neuman, 2015].
Указанное обозначило целый ряд методических задач, без решения которых, существенно снижаются темпы получения новых научных данных о поведении бактерий в сложных модельных системах, например, таких, как желудочно-кишечный тракт [Marco, 2006]. К числу таких задач можно отнести необходимость флуоресцентного маркирования штаммов посредством клонирования соответствующих генов, обеспечивающих витальную экспрессию флуорофоров, что позволит исследовать in vivo как закономерности колонизации кишечника [van Zyl, 2015], так и особенности симбиотических взаимоотношений, например, почвенных микроорганизмов, имеющих сельскохозяйственное значение [Баймиев,
2011] .
Вместе с тем перечень флуоресцентных белков, применимых для прижизненного маркирования микроорганизмов относительно невелик, поскольку для их практического использования они должны соответствовать ряду критериев. В частности, интенсивность их свечения должна превышать уровень исходной аутофлуоресценции клетки. Флуорохромный белок должен быть фотостабильным, что позволит
обнаруживать его в течение длительного периода. И, наконец, не должен быть токсичным для экспрессирующей его клетки [Kilaru, 2015]. Одним из первых белков, который соответствовал всем перечисленным требованиям, был зеленый флуоресцентный белок экворин (GFP, в присутствии ионов Ca - голубой), выделенный из медузы Aequorea victoria [Shimomura, 1962]. Ген GFP был впервые клонирован в 1992 году [Prasher, 1992], а впоследствии эффективно экспрессировался как в прокариотических, так и эукариотических клетках [Chalfie, 1994; Inouye, 1994]. Однако стоит
отметить, что для образования зрелого белка необходима температура ниже 37 градусов, так как в естественных условиях медуза обитает в холодных водах. В настоящее время целесообразнее применять белок TurboGFP выделенный из копеподы Pontellina plumata, со способностью к эффективному фолдингу при более высоких градусах цельсия [Зубова, 2006]. Сейчас он успешно применялся на широком круге хозяев для установления внутриклеточной локализации и динамики белков, при изучении механизмов экспрессии и межмолекулярных взаимодействий, в качестве биосенсора [Voss, 2013].
Одним из общепризнано безопасных и наиболее биотехнологически популярных биологических объектов в последние годы становятся Bacillus subtilis. Это связано с доказанной возможностью получения при использовании указанных бактерий различных ферментов и сверхэкспрессии целого ряда рекомбинантных белков, представляющих интерес для фармацевтики и промышленности, таких как амилаза [Chen, 2015], липаза [Lu, 2010], щелочная полигалактоуронатлиаза [Zhang, 2013]. Кроме того B.subtilis формируют культуры очень высокой плотности, продуцируемые субстраты выделяются в культуральную жидкость, из которой они могут быть выделены и очищены. Несмотря на это до настоящего времени надежные способы маркирования Bacillus subtilis не разработаны.
В связи с этим целью настоящего исследования стало получение пробиотического штамма Bacillus subtilis 3H, флуоресцентно меченного флуоресцентным белком TurboGFP из копеподы Pontellina plumata.
Для решения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
1. Создать генно-инженерную конструкцию, несущую ген флуоресцентного белка под управлением сильного промотора.
2. Провести трансформацию клеток Bacillus subtilis 3H созданной генно-инженерной конструкцией.
3. Провести скрининг флуоресцентно-меченных клонов бактерий.
4. Сравнить интенсивность флуоресцентного свечения полученного маркированного штамма B.subtilis 3H со штаммом E.coli, несущим тот же ген gfp.
1. На основе плазмиды pDG1662 создана генно-инженерная конструкция, несущая ген turbogfp под управлением промотора фага Т5, предназначенная для переноса целевого гена в клетки B.subtilis по механизму естественной трансформации.
2. С применением полученной конструкции получены витально маркированные GFP клоны B.subtilis 3H.
3. Интенсивность флуоресцентного свечения клеток полученного рекомбинантного штамма B.subtilis 3H уступает интенсивности свечения E.coli, несущих тот же ген зеленого флуоресцентного белка, что может быть следствием как отличающейся активности промотора фага Т5 в разных бактериях, так и отличий в копийности целевого гена у этих бактерий.
4. Использование промотора фага Т5 в конструкциях для маркирования бактерий B.subtilis зеленым флуоресцентным белком является нецелесообразным из-за низкой индукции управляемого им гена в данных микроорганизмах, что приводит к низкой интенсивности флуоресценции клеток, недостаточной для их детекции в ЖКТ.
