Количественная оценка содержания пародонтопатогенов в очагах поражения до и после лечения для оценки эффективности терапии в стоматологии
|
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1. Современные представления о пародонтите 9
1.2. Видовой состав постоянной микрофлоры полости рта 13
1.3. Микрофлора полости рта при пародонтите 17
1.4. Лабораторная диагностика пародонтита 23
1.4.1. Классификация Хазановой В.В., 1993 23
1.4.2. Микробиологические методы диагностики 24
1.4.3. Оптические методы диагностики 24
1.4.4. Иммунологические методы диагностики 25
1.4.5. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 26
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 28
2.1. Объекты исследования 28
2.2. Выделение ДНК из клинических образцов 30
2.3. Конструирование калибровочного образца 31
2.4. Конструирование положительных образцов 33
2.5. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 34
2.6. Электрофорез 35
2.7. ПЦР в режиме реального времени 37
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ... 39
3.1 Определение объема жидкости, впитываемого бумажным эндодонтическим штифтом (размер №25) 39
3.2. Оценка частоты встречаемости пародонтопатогенных
микроорганизмов у больных ХГП до проведения терапии 40
3.3. Анализ ассоциативных связей между пародонтопатогенными
микроорганизмами различных видов в клиническом материале больных ХГП 43
3.4. Качественная оценка содержания пародонтопатогенных
микроорганизмов в клиническом материале больных ХГП с разными схемами лечения 46
3.5. Количественная оценка содержания пародонтопатогенных
микроорганизмов в клиническом материале больных ХГП с разными схемами лечения 51
ВЫВОДЫ 60
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 62
ПРИЛОЖЕНИЕ 74
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1. Современные представления о пародонтите 9
1.2. Видовой состав постоянной микрофлоры полости рта 13
1.3. Микрофлора полости рта при пародонтите 17
1.4. Лабораторная диагностика пародонтита 23
1.4.1. Классификация Хазановой В.В., 1993 23
1.4.2. Микробиологические методы диагностики 24
1.4.3. Оптические методы диагностики 24
1.4.4. Иммунологические методы диагностики 25
1.4.5. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 26
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 28
2.1. Объекты исследования 28
2.2. Выделение ДНК из клинических образцов 30
2.3. Конструирование калибровочного образца 31
2.4. Конструирование положительных образцов 33
2.5. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 34
2.6. Электрофорез 35
2.7. ПЦР в режиме реального времени 37
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ... 39
3.1 Определение объема жидкости, впитываемого бумажным эндодонтическим штифтом (размер №25) 39
3.2. Оценка частоты встречаемости пародонтопатогенных
микроорганизмов у больных ХГП до проведения терапии 40
3.3. Анализ ассоциативных связей между пародонтопатогенными
микроорганизмами различных видов в клиническом материале больных ХГП 43
3.4. Качественная оценка содержания пародонтопатогенных
микроорганизмов в клиническом материале больных ХГП с разными схемами лечения 46
3.5. Количественная оценка содержания пародонтопатогенных
микроорганизмов в клиническом материале больных ХГП с разными схемами лечения 51
ВЫВОДЫ 60
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 62
ПРИЛОЖЕНИЕ 74
Актуальность проблемы
Воспалительные заболевания пародонта представляют серьезную проблему в современной стоматологии в связи с большой распространенностью среди взрослого населения, наличием клинических форм, приводящих к разрушению зубочелюстной системы и потере зубов, сложностью диагностики, недостаточной эффективностью лечения и частотой возникновения рецидивов заболевания [Безрукова И.В. с соавт., 2002; Барер Г.М. с соавт., 2006; Соловьева A.M. с соавт., 2006]. По данным ВОЗ у лиц в возрасте 15-19 лет пародонтит регистрируется в 55-89% случаев, в возрасте 35-44 лет и в старших возрастных группах заболеваемость пародонтитом регистрируется уже в 65-98%. [Давыдова Т.Р. с соавт., 2001; Грудянов А. И. с соавт., 2010; Луцкая И. К., 2010].
Согласно современным представлениям, возникновение и прогрессирование воспалительных заболеваний пародонта связывают с влиянием микроорганизмов, обладающих факторами агрессии к тканям пародонтального комплекса [Грудянов А.И. с соавт., 2009; Thiha K. Et al., 2007; Corraini P. et al., 2012]. Резкое увеличение количества резидентной микрофлоры при неудовлетворительной гигиене или появление в составе микрофлоры полости рта пародонтопатогенных микроорганизмов, обладающих повышенными адгезивными, инвазивными и токсическими свойствами, приводит к деструктивным изменениям всего комплекса поддерживающих структур зуба. Известно, что наиболее часто встречающимися являются пародонтопатогенные виды бактерий Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Tanerella forsythensis, Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum и Treponema denticola. Развиваясь в суббиотопах полости рта, условно-патогенные и патогенные бактерий, образуют отдельный микробиоценоз (зубную бляшку), способствующий разрушению зубодесневого аппарата и резорбции альвеолярной кости. [Simonson L.G. et al. 1992; Haffajee A.D. et al., 1994; Maiden M.F. et al., 2003; Царев В.Н. с соавт., 2004; Чепуркова
O. А. с соавт., 2007].
Количество идентифицированных в настоящее время на поверхности зубов и слизистой оболочке рта видов бактерий, находящихся в динамическом равновесии и образующих микробиоценоз, превышает 700. [Tong K.Z. et al., 2003; Aas. J.A. et al., 2005; Wara-Aswapati N. et al., 2007; Queiroz-Junior C.M. et al., 2009]. Более половины представителей микробиоты полости рта не поддаются культивированию, поэтому данные о количественных соотношениях бактерий в настоящее время практически отсутствуют. Во многом последнее обусловлено недостаточной информативностью применяемых на современном этапе методов (микроскопических, бактериологических и др.), не позволяющих выявлять весь спектр анаэробных, микроаэрофильных и некультивируемых бактерий. Такая диагностика пародонтита в настоящее время ограничивается констатацией очага уже необратимой инфекционной деструкции ткани. В этой связи представляется целесообразным использование молекулярно-генетических методов, не требующих выделения чистой культуры.
В практической стоматологии комплексное лечение воспалительно-деструктивных заболеваний пародонта чаще всего осуществляют с применением антибактериальных средств. Однако, длительное, бесконтрольное их применение приводит к многочисленным осложнениям: лекарственной толерантности, ослаблению лечебного
эффекта, дисбактериозу полости рта и желудочно-кишечного тракта и т.д. Основные лечебные мероприятия направлены на купирование воспалительного процесса в пародонте, предупреждение распространения процесса вглубь, восстановление анатомической структуры пародонта, достижение стабильной ремиссии. [Григорьян А.С. с соавт., 2009; Ламонт
P. Дж. с соавт., 2010; Недосеко В.Б. с соавт., 2010; Gamboa F. Et al., 2013].
Следовательно, вопросы диагностики, профилактики и лечения воспалительных заболеваний пародонта остаются актуальными. Успех лечения напрямую зависит от своевременной диагностики, комплексного подхода к лечению, адекватного консервативного и хирургического лечения.
Современные молекулярно-генетические методы исследования открывают широкие возможности для ранней диагностики, оценки и прогнозирования лечения пациентов с воспалительными заболеваниями пародонта. [Янушевич О.О. с соавт., 2010; Зорина О.А. с соавт., 2011; Иванюшко Т.П. с соавт., 2011; Eke P.I., 2011]. Ранняя и точная диагностика может позволить в будущем уменьшить распространение пародонтита и прогрессию его течения.
Цель исследования
Молекулярно-генетическое исследование состава и количественного содержания пародонтопатогенных микроорганизмов в ротовой полости пациентов для оценки эффективности лечения пародонтита.
Задачи исследования
1. Сбор клинического материала из пародонтальных карманов и слюны больных хроническим генерализованным пародонтитом средней и тяжелой степени тяжести.
2. Выделение бактериальной ДНК из собранного клинического материала.
3. ПЦР-анализ образцов ДНК, выделенных из клинических образцов больных пародонтитом на наличие участков генов 16S рРНК Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, Streptococcus oralis, Streptococcus sanguis и Streptococcus sobrinus.
4. Количественный анализ методом ПЦР в режиме реального времени содержания участков генов 16S рРНК Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, Streptococcus oralis, Streptococcus sanguis и Streptococcus sobrinus в положительных клинических образцах больных пародонтитом до и после лечения.
Практическая значимость
Сконструирован калибровочный образец pAL-TAStrSob16S (7,08х1011 копий ДНК/мл) для количественного определения содержания пародонтопатогенных бактерий Porphyromonas gingivalis,
Treponema denticola, Streptococcus oralis, Streptococcus sanguis,
Streptococcus sobrinus в выравненных по объему клинических образцах с помощью метода ПЦР в режиме реального времени.
Область применения результатов исследования
Идентификация основных возбудителей пародонтита методом ПЦР и количественная оценка эффективности терапии методом ПЦР в режиме реального времени может стать основой при ранней диагностики, постановки диагноза, мониторинга и прогнозирования течения воспалительных заболеваний пародонта.
Воспалительные заболевания пародонта представляют серьезную проблему в современной стоматологии в связи с большой распространенностью среди взрослого населения, наличием клинических форм, приводящих к разрушению зубочелюстной системы и потере зубов, сложностью диагностики, недостаточной эффективностью лечения и частотой возникновения рецидивов заболевания [Безрукова И.В. с соавт., 2002; Барер Г.М. с соавт., 2006; Соловьева A.M. с соавт., 2006]. По данным ВОЗ у лиц в возрасте 15-19 лет пародонтит регистрируется в 55-89% случаев, в возрасте 35-44 лет и в старших возрастных группах заболеваемость пародонтитом регистрируется уже в 65-98%. [Давыдова Т.Р. с соавт., 2001; Грудянов А. И. с соавт., 2010; Луцкая И. К., 2010].
Согласно современным представлениям, возникновение и прогрессирование воспалительных заболеваний пародонта связывают с влиянием микроорганизмов, обладающих факторами агрессии к тканям пародонтального комплекса [Грудянов А.И. с соавт., 2009; Thiha K. Et al., 2007; Corraini P. et al., 2012]. Резкое увеличение количества резидентной микрофлоры при неудовлетворительной гигиене или появление в составе микрофлоры полости рта пародонтопатогенных микроорганизмов, обладающих повышенными адгезивными, инвазивными и токсическими свойствами, приводит к деструктивным изменениям всего комплекса поддерживающих структур зуба. Известно, что наиболее часто встречающимися являются пародонтопатогенные виды бактерий Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Tanerella forsythensis, Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum и Treponema denticola. Развиваясь в суббиотопах полости рта, условно-патогенные и патогенные бактерий, образуют отдельный микробиоценоз (зубную бляшку), способствующий разрушению зубодесневого аппарата и резорбции альвеолярной кости. [Simonson L.G. et al. 1992; Haffajee A.D. et al., 1994; Maiden M.F. et al., 2003; Царев В.Н. с соавт., 2004; Чепуркова
O. А. с соавт., 2007].
Количество идентифицированных в настоящее время на поверхности зубов и слизистой оболочке рта видов бактерий, находящихся в динамическом равновесии и образующих микробиоценоз, превышает 700. [Tong K.Z. et al., 2003; Aas. J.A. et al., 2005; Wara-Aswapati N. et al., 2007; Queiroz-Junior C.M. et al., 2009]. Более половины представителей микробиоты полости рта не поддаются культивированию, поэтому данные о количественных соотношениях бактерий в настоящее время практически отсутствуют. Во многом последнее обусловлено недостаточной информативностью применяемых на современном этапе методов (микроскопических, бактериологических и др.), не позволяющих выявлять весь спектр анаэробных, микроаэрофильных и некультивируемых бактерий. Такая диагностика пародонтита в настоящее время ограничивается констатацией очага уже необратимой инфекционной деструкции ткани. В этой связи представляется целесообразным использование молекулярно-генетических методов, не требующих выделения чистой культуры.
В практической стоматологии комплексное лечение воспалительно-деструктивных заболеваний пародонта чаще всего осуществляют с применением антибактериальных средств. Однако, длительное, бесконтрольное их применение приводит к многочисленным осложнениям: лекарственной толерантности, ослаблению лечебного
эффекта, дисбактериозу полости рта и желудочно-кишечного тракта и т.д. Основные лечебные мероприятия направлены на купирование воспалительного процесса в пародонте, предупреждение распространения процесса вглубь, восстановление анатомической структуры пародонта, достижение стабильной ремиссии. [Григорьян А.С. с соавт., 2009; Ламонт
P. Дж. с соавт., 2010; Недосеко В.Б. с соавт., 2010; Gamboa F. Et al., 2013].
Следовательно, вопросы диагностики, профилактики и лечения воспалительных заболеваний пародонта остаются актуальными. Успех лечения напрямую зависит от своевременной диагностики, комплексного подхода к лечению, адекватного консервативного и хирургического лечения.
Современные молекулярно-генетические методы исследования открывают широкие возможности для ранней диагностики, оценки и прогнозирования лечения пациентов с воспалительными заболеваниями пародонта. [Янушевич О.О. с соавт., 2010; Зорина О.А. с соавт., 2011; Иванюшко Т.П. с соавт., 2011; Eke P.I., 2011]. Ранняя и точная диагностика может позволить в будущем уменьшить распространение пародонтита и прогрессию его течения.
Цель исследования
Молекулярно-генетическое исследование состава и количественного содержания пародонтопатогенных микроорганизмов в ротовой полости пациентов для оценки эффективности лечения пародонтита.
Задачи исследования
1. Сбор клинического материала из пародонтальных карманов и слюны больных хроническим генерализованным пародонтитом средней и тяжелой степени тяжести.
2. Выделение бактериальной ДНК из собранного клинического материала.
3. ПЦР-анализ образцов ДНК, выделенных из клинических образцов больных пародонтитом на наличие участков генов 16S рРНК Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, Streptococcus oralis, Streptococcus sanguis и Streptococcus sobrinus.
4. Количественный анализ методом ПЦР в режиме реального времени содержания участков генов 16S рРНК Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, Streptococcus oralis, Streptococcus sanguis и Streptococcus sobrinus в положительных клинических образцах больных пародонтитом до и после лечения.
Практическая значимость
Сконструирован калибровочный образец pAL-TAStrSob16S (7,08х1011 копий ДНК/мл) для количественного определения содержания пародонтопатогенных бактерий Porphyromonas gingivalis,
Treponema denticola, Streptococcus oralis, Streptococcus sanguis,
Streptococcus sobrinus в выравненных по объему клинических образцах с помощью метода ПЦР в режиме реального времени.
Область применения результатов исследования
Идентификация основных возбудителей пародонтита методом ПЦР и количественная оценка эффективности терапии методом ПЦР в режиме реального времени может стать основой при ранней диагностики, постановки диагноза, мониторинга и прогнозирования течения воспалительных заболеваний пародонта.
1. Установлено, что у пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом средней и тяжелой степени тяжести в содержимом пародонтальных карманов преобладают пародонтопатогенные виды - Streptococcus sobrinus (6,4*108 копий ДНК/мл) и Porphyromonas gingivalis (7,5*107 копий ДНК/мл). В образцах слюны у больных достоверно чаще обнаруживаются пародонтопатогены - Streptococcus sobrinus (3,6*108 копий ДНК/мл) и Treponema denticola (1,3*107 копий ДНК/мл).
2. Обнаружение пародонтопатогена Streptococcus sobrinus методом ПЦР в содержимом пародонтальных карманов значимо как в монокультуре, так и в ассоциации Streptococcus mutans - Streptococcus oralis - Streptococcus sanguis - Streptococcus sobrinus. Соответственно выявление данного пародонтопатогена в содержимом пародонтальных карманов и/или в слюне у больных хроническим генерализованым пародонтитом имеет диагностическое значение.
3. Пародонтопатогенные микроорганизмы Streptococcus oralis, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguis и Streptococcus sobrinus наиболее чаще образуют микробные ассоциации: Streptococcus mutans - Streptococcus oralis - Streptococcus sanguis - Streptococcus sobrinus (34%), Streptococcus mutans - Streptococcus sanguis - Streptococcus oralis (34%) в содержимом пародонтальных карманов и Streptococcus mutans - Streptococcus oralis (61%) в слюне.
4. Комбинированное лечение, включающее Vector-терапию и
курс антибиотиков характеризуется наибольшей эффективностью, регрессией воспалительных реакций в тканях пародонта, улучшением клинического течения пародонтита, увеличением ремиссии, а также снижением общей бактериальной обсемененности тканей пародонтопатогенами Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola и представителями условно-патогенной микрофлоры полости рта Streptococcus oralis, Streptococcus sanguis, Streptococcus sobrinus.
2. Обнаружение пародонтопатогена Streptococcus sobrinus методом ПЦР в содержимом пародонтальных карманов значимо как в монокультуре, так и в ассоциации Streptococcus mutans - Streptococcus oralis - Streptococcus sanguis - Streptococcus sobrinus. Соответственно выявление данного пародонтопатогена в содержимом пародонтальных карманов и/или в слюне у больных хроническим генерализованым пародонтитом имеет диагностическое значение.
3. Пародонтопатогенные микроорганизмы Streptococcus oralis, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguis и Streptococcus sobrinus наиболее чаще образуют микробные ассоциации: Streptococcus mutans - Streptococcus oralis - Streptococcus sanguis - Streptococcus sobrinus (34%), Streptococcus mutans - Streptococcus sanguis - Streptococcus oralis (34%) в содержимом пародонтальных карманов и Streptococcus mutans - Streptococcus oralis (61%) в слюне.
4. Комбинированное лечение, включающее Vector-терапию и
курс антибиотиков характеризуется наибольшей эффективностью, регрессией воспалительных реакций в тканях пародонта, улучшением клинического течения пародонтита, увеличением ремиссии, а также снижением общей бактериальной обсемененности тканей пародонтопатогенами Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola и представителями условно-патогенной микрофлоры полости рта Streptococcus oralis, Streptococcus sanguis, Streptococcus sobrinus.
