ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Общие сведения о бактериях рода Acinetobacter spp.
1.1.1. История и таксономия
1.1.2. Таксономическое положение
1.2. Общая микробиологическая характеристика бактерий рода Acinetobacter spp.
1.2.1. Биохимические свойства
1.2.2. Экология ацинетобактерий
1.3. Эпидемиология
1.4. Роль Acinetobacter spp. в возникновении нозокомиальных инфекций.
1.4.1. Респираторные инфекции
1.4.2. Бактериемии
1.4.3. Менингиты
1.5. Патогенез инфекций, вызванных Acinetobacter spp.
1.5.1. Предрасполагающий фактор
1.5.2. Вирулентность
1.5.2.1. Белки внешней мембраны OmpA.
1.6. Stenotrophomonas maltophilia: общие представления.
1.6.1. Таксономия
1.6.2. Эпидемиология S. maltophilia
1.6.3. Факторы патогенности
1.7. Лабораторные методы исследования.
1.7.1. Бактериологическое исследование
1.7.2. Масс-спектрометрия по технологии MALDI-ToF
1.7.3. Полимеразная цепная реакция
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объекты исследования.
2.2. Приготовление питательных сред для выделения микроорганизмов из клинических образцов и выделение чистой культуры.
2.3. Идентификация микроорганизмов масс-спектрометрическим анализом по технологии MALDI-ToF.
2.4. Подбор олигонуклеотидных праймеров для проведения полимеразной цепной реакции.
2.5. Выделение ДНК из клинических образцов.
2.6. Проведение полимеразной цепной реакции препаратов ДНК Acinetobacter spp. на выявление гена, кодирующего белок внешней мембраны OmpA.
2.7. Детекция ПЦР-продуктов методом электрофореза в агарозном геле.
ГЛАВА III РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Выделение клинических штаммов неферментирующих грамотрицательных бактерий.
3.2. Масс-спектрометрия.
3.3. Антибиотикочувствительность A. baumanii.
3.4. Проверка специфичности праймеров на Acinetobacter spp.
3.5. Интерпретация результатов проведенного ПЦР-анализа ДНК Acinetobacter spp. с последующим электрофорезом в агарозном геле.
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ
В настоящее время в числе серьезных возбудителей госпитальных инфекций рассматриваются бактерии родов Acinetobacter и Stenotrophomonas. Эти микроорганизмы являются условно-патогенными, но при снижении иммунитета или на фоне болезни могут усугубить ситуацию или вызвать новое заболевание. Естественным резервуаром для Acinetobacter и Stenotrophomonas является почва и природные водоемы. В госпитальных условиях эти микроорганизмы могут быть обнаружены на кухонных принадлежностях, системах вентиляции и увлажнения, на инструментах для уборки помещений, на различном медицинском оборудовании (таких, как небулайзеры, аппараты диализа, контуры аппаратов искусственной вентиляции), в субстрате комнатных растений, на коже рук персонала больницы и даже в дезинфицирующих растворах.
Ацинетобактеры обычно вызывают нозокомиальные инфекции:
-пневмонии,
- подострые и острые бактериальные эндокардиты,
-бактериемии и септицемии,
-урологические инфекции,
-менингиты ( при нейрохирургических вмешательствах ).
-раневые и ожоговые инфекции.
Stenotrophomonas maltophilia вызывает инфекции:
-пневмония,
-сепсис,
-раневые инфекции,
инфекции мочевыводящих путей,
-эндокардиты,
-инфекции ЦНС.
В докладе Всемирной Организации Здравоохранения " «Противомикробные средства на стадии клинической разработки - аналитическое исследование процесса клинической разработки противомикробных средств, включая средства против туберкулеза» от 20.09.2017 указано, что существует серьезный дефицит средств для лечения инфекций, вызванных широкой лекарственной устойчивостью Acinetobacter и Stenotrophomonas. Также, 27.02.2017 ВОЗ публикует список бактерий, для борьбы с которыми требуется немедленное создание новых антимикробных лекарственных средств; бактерия Acinetobacter baumannii вошла в первую категорию приоритетности: критически высокий уровень приоритетности, так как она устойчива к карбапенемам.
Цель исследования
Детекция генов в клинических образцах для оценки их этиологической значимости.
Задачи исследования
1. Анализ литературных данных;
2. Подбор праймеров в генетическом банке;
3. Выделение чистой культуры из клинических образцов, создание инокулята;
4. Выделение ДНК из инокулята;
5. Проведение ПЦР-анализа и гель-электрофореза;
6. Оценка диагностической ценности.
Важнейшей характеристикой праймеров, используемых для клинической идентификации ДНК микроорганизмов-возбудителей тех или иных заболеваний, является их специфичность. Произвели проверку отжига праймеров на ДНК других бактерий. Для этого использовали ДНК музейной культуры бактерии Pseudomons aeruginosa. Для положительного контроля использовали музейную культуру Acinetobacter spp, для отрицательного контроля - 0,9% физиологический раствор. В результате подобранные
праймеры не сработали на образце ОКО и Pseudomonas aeruginosa. Таким образом, можно сказать, что подобранные нами праймеры обладают специфичностью и не будут показывать ложноположительный результат.
3.4. Интерпретация результатов проведенного ПЦР-анализа ДНК Acinetobacter spp. с последующим электрофорезом в агарозном геле.
В ходе классической полимеразной цепной реакции амплифицировали участок молекулы ДНК бактерий рода Acinetobacter spp, содержащий ген, кодирующий белок внешней мембраны OmpA. В результате обнаружили, что из 28 исследуемых образцов положительными оказались 24 образца, отрицательными - 4 образца.
