Список сокращений и условных обозначений 4
ВВЕДЕНИЕ 5
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. Современные представления о воспалительных заболеваниях пародонта 8
1.2. Основные аспекты этиологии и патогенеза воспалительных заболеваний пародонта 9
1.3. Общая характеристика и классификация представителей рода Streptococcus 18
1.4. Описание отдельных представителей рода Streptococcus 25
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 32
2.1. Объекты исследования 32
2.2. Приготовление селективных питательных сред 33
2.3. Условия культивирования микроорганизмов 40
2.4. Описание культуральных свойств выросших колоний 40
2.5. Описание тинкториальных свойств выросших колоний 42
2.6. Выделение бактериальной ДНК из выросших колоний 44
2.7. Проведение ПЦР в режиме реального времени 45
2.8. Проведение MALDI-TOF масс-спектрометрического анализа
выделенных штаммов стрептококков 47
2.9. Метод длительного хранения коллекционных культур микроорганизмов 49
2.10. Определение антимикробной активности растительных экстрактов 50
2.11. Определение противомикробной активности химических соединений 51
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 53
3.1. Исследование культуральных свойств выросших колоний 53
3.2. Исследование тинкториальных свойств выросших колоний 61
3.3. Проведение MALDI-TOF масс-спектрометрического анализа выделенных штаммов стрептококков 63
3.4. Проведение молекулярно-генетического анализа выделенных штаммов стрептококков 66
3.5. Реализация метода длительного хранения коллекционных культур пародонтопатогенных микроорганизмов 69
3.6. Определение антимикробной активности растительных экстрактов полуколичественным диско-диффузионным методом 70
3.7. Определение противомикробной активности химических соединений полуколичественным диско-диффузионным методом 72
ВЫВОДЫ 85
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 86
ПРИЛОЖЕНИЕ 94
Актуальность. В последние годы повсеместно отмечается увеличение заболеваемости пародонтитом, что представляет собой серьезную проблему, особенно для взрослого населения, у которых частота встречаемости пародонтита достигает 98% случаев (Darby et al., 2005; Грудянов, Фоменко, 2010; Луцкая, 2010; Ramich et al., 2014).
Пародонтит - это инфекционно-воспалительное поражение всего комплекса поддерживающих структур зубов с прогрессирующей деструкцией десны, пародонтальной связки и альвеолярной кости, ведущее к полной утрате зубов (Thiha et al., 2007; Грудянов и др, 2009; Corraini et al.,2012). Развитие этой патологии связывают с формированием микробной биопленки в придесневых областях и межзубных промежутках, где пародонтопатогенные микроорганизмы продуцируют комплекс ферментов, способствующих нарушению целостности эпителиальных тканей, разрушению зубодесневого аппарата, сенсибилизации макроорганизма и изменению иммунореактивности. Прогрессирование обусловленного бактериями воспалительного процесса сопровождается пролиферацией и погружным ростом эпителия, разволокнением и разрушением волокон периодонта (Fowler et al., 2001; Булкина и др., 2006; Cullinan et al., 2010; Лукиных и др., 2011). Антибиотикотерапия таких процессов недостаточно эффективна, поскольку не обеспечивает нейтрализации уже образовавшихся продуктов микробного происхождения, которые в настоящее время, несмотря на многочисленные публикации, изучены недостаточно (Косенко и др., 2000; Цепов и др., 2005; Зорина и др., 2011; Добреньков и др., 2014; Вечерковская, 2015).
Во многих исследованиях показано, что наиболее часто встречающимися являются пародонтопатогенные виды бактерий Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Tanerella forsythensis, Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum и Treponema denticola (Maiden et al., 2003; Царев и др., 2004; Чепуркова и др., 2007; Simonson et al., 2012; Haffajee et al., 2014). В то же время охарактеризованы некоторые факторы патогенности, оказывающие наиболее значительный эффект на структурную и функциональную целостность десневого эпителия (Scheres et al., 2010; Царев и др., 2014; Triantafilou et al., 2014). Однако в целом патогенный потенциал пародонтопатогенных микроорганизмов остаётся недостаточно изученным.
Среди многочисленных причин сложившейся ситуации, в качестве одной из основных рассматривают отсутствие коллекций пародонтопатогенных микроорганизмов, являющихся преимущественно облигатно анаэробными и микроаэрофильными бактериями. В этой связи в специальной литературе данные о физиологии, биохимии и генетике этих бактерий немногочисленны и отрывочны. Вместе с тем, комплексная микробиологическая характеристика пародонтопатогенов могла бы оказаться полезной для разработки новых терапевтических подходов, основанных на нейтрализации протеолитических ферментов этих бактерий, для создания новых, эффективных в стоматологии, пре- и пробиотиков и препаратов, повышающих неспецифическую резистентность.
Цель исследования. Сформировать коллекцию клинических штаммов микроорганизмов, ассоциируемых с патологией пародонта, для разработки новых способов диагностики и лечения пародонтита.
Задачи исследования
1. Сбор клинического материала из пародонтальных карманов больных хроническим генерализованным пародонтитом средней степени тяжести.
2. Подбор питательных сред и условий для выделения и культивирования пародонтопатогенных микроорганизмов.
3. Проведение MALDI-TOF масс-спектрометрического анализа выделенных штаммов бактерий.
4. Проведение молекулярно-генетического анализа выделенных штаммов бактерий.
5. Определение антимикробной активности веществ различной природы с использованием выделенных штаммов пародонтопатогенных микроорганизмов.
Практическая значимость
Впервые будет сформирована коллекция пародонтопатогенных микроорганизмов, имеющих клиническое значение при развитии воспалительных заболеваний пародонта. Будут изучены факторы патогенности пародонтопатогенных микроорганизмов и их роль в развитии патологических состояний.
1. Представители рода Streptococcus входят в состав пародонтальных комплексов, обуславливающих воспалительно-деструктивные процессы в тканях пародонта, и соответственно являются предикторами прогрессирования заболевания. Это связано с интенсивным ростом и размножением бактерий в пародонтальных карманах при развитии воспалительных процессов.
2. Выделенные чистые культуры штаммов бактерий рода Streptococcus (Streptococcus mitis, Streptococcus sanguis, Streptococcus oralis, Streptococcus sobrinus) позволяют проводить испытания новых антибактреиальных препаратов в отношении патогенный микрофлоры при пародонтите.
3. Оценка антимикробной активности растительных экстрактов в
отношении условно-патогенных микроорганизмов показала, что экстракты травы тысячелистника (herba Millefolii), цветков календулы (flores Calendulae) аптечного препарата - 10% настойкой прополиса и смеси
экстрактов травы тысячелистника (herba Millefolii), цветков календулы (flores Calendulae) и 10% настойки прополиса подавляют рост условно-патогенных микроорганизмов Escherichia coli, Candida albicans, Staphylococcus aureus, Streptococcus oralis.
4. Оценка противомикробной активности химических соединений в отношении условно-патогенных микроорганизмов показала, что данные соединения подавляют рост таких условно-патогенных микроорганизмов как Escherichia coli, Candida albicans, Staphylococcus aureus, Streptococcus oralis.
