ВВЕДЕНИЕ 4
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 4
1.1. Эпидемиология 7
1.2. Диагностика мочекаменной болезни 7
1.3. Классификация и химический состав почечных
камней 8
1.3.1. Классификация камней в зависимости от их химического
состава 8
1.3.2. Классификация камней в зависимости от водородного показателя
мочи 10
1.4. Коралловидный нефролитиаз 11
1.5. Роль бактерий в образовании коралловидных
камней 12
1.5. Семейство Enterobacteriaceae 15
1.6.1. Escherichia coli 15
1.6.2. Klebsiella pneumonia 15
1.6.3. Proteus mirabilis 16
1.6.4. Morganella 16
1.7. Семейство Staphylococcaceae 17
1.7.1. Род Staphylococcus spp 17
1.8 Семейство Pseudomonadaceae 18
1.8.1 Род Pseudomonas 18
1.9. Патогенность бактерий 19
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 22
2.1. Клинико-лабораторное обследование больных 22
2.2. Сбор клинических образцов 22
2.3 Выделение бактериальной ДНК 23
2.3.1 Выделение бактериальной ДНК набором ДНК «сорб-
ам» 23
2.3.2 Выделение бактериальной ДНК методом солевой
экстракции 24
2.4. Амплификация участков ДНК геномов микроорганизмов методом
полимеразной цепной реакции 25
2.5. Электрофоретический анализ ДНК в агарозном
геле 27
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 29
3.1. Идентификация бактерий молекулярно - генетическими методами 29
Заключение 36
Выводы 37
Список литературы 38
Приложения 42
Уролитиаз (мочекаменная болезнь) занимает главное место в урологических болезнях. В литературных источниках есть данные, что 10% населения Европы, 15% -Америки, 8% - Азии и до 30% - в других странах востока страдают мочекаменной болезнью. В индустриально развитых странах выявляется до 2 млн. случаев камнеобразования в мочевыводящих путях на 2 млн населения за год .
Лечение МКБ дорогостоящее. Так как отмечается рост заболеваемости, и разрабатываются высокоэффективные дорогостоящие технологии лечения уролитиаза. Например, в южных странах Европы на лечение мочекаменной болезни тратится около 100 млн евро в год. Такая же сумма тратится на лечение МКБ в Англии. В Германии тоже наблюдается рост заболеваемости МКБ с 0,6% в 1980 году до 1,5% в 2000 году: первичной заболеваемости от 0,1% до 0,7%; рецидивного
камнеобразования от 0,4% до 0,8%. На стационарное лечение МКБ в этой стране выделяется 500 млн. евро в год. В Европе лечение пациентов с МКБ обходится примерно в 3 млрд евро в год. Уровень заболеваемости
мочекаменной болезнью растет в странах СНГ. Он варьирует в пределах 150-200 случаев на 100 000 населения в Российской Федерации 220-290 случаев на 100 000.
Известно, что при МКБ делают определение видового состава микробиоты мочевыводящей системы. Не известно влияет ли микрофлора на образование камней или же наоборот.
Представители семейства Enterobacteriaceae часто выявляется при мочекаменной болезни. Эти бактерии в основном условно-патогенные. Есть сведения, что эти микроорганизмы могут принимать участие в патогенезе инфекций мочевыводящих путей, и так влиять на возникновение и течение МКБ. Особый интерес представляет изучение
изменения состава микробиоты представителей
семейства Enterobacteriaceae коралловидных камней, потому что микроорганизмы могут негативно влиять на развитие заболевания.
Вместе с тем мнения по данному вопросу очень противоречивы, так как выявляемость микроорганизмов при данной патологии традиционными методами (микроскопия, культуральный) невозможна. Необходимые данные можно получить при использовании молекулярно-генетических методов, например, ПЦР. Эти методы обладают высокой
чувствительностью и специфичностью.
Целью работы является молекулярно-генетическая характеристи-ка видового состава микробиоты коралловидных камней при мочекаменной болезни и оценка роли в этом процессе представителей семейства Enterobacteriaceae.
Задачи исследования:
1. Установить наиболее информативные ДНК-мишени, позволяющие определить видовой состав энтеробактерий.
2. Подобрать видоспецифичные праймеры для ПЦР-
идентификации бактерий.
3. Собрать коллекцию клинических образцов
коралловидных камней.
4. Выделить тотальную ДНК из клинического материала.
5. Провести ПЦР-анализ, выделенной ДНК, при помощи подобранных праймеров.
6. Определить видовой состав бактерий.
Целью работы являлось идентификация бактерий мочевых камней. Для этого удобно использовать ПЦР с двумя специфическими праймерами.
Из образцов мочевых камней методом солевой экстракции нам удалось выделить следовую ДНК в малых количествах. Но этого хватило для проведения ПЦР-анализа. Были обнаружены ДНК условно-патогенных энтеробактерий, преимущественно отнесенных к 4 видам: Klebsiella pneumoniae, Ecsherichia coli, Proteus mirabilis и Hafnia alvei. Для идентификации видового состава энтеробактерий были подобраны праймеры для таких родов как Citrobacter, Escherichia, Hafnia, Klebsiella и Proteus. Подобранные праймеры сработали у четырёх родов: Escherichia, Klebsiella, Proteus, Hafnia. Праймеры для 5'. aureus и P. aeruginosa тоже сработали, но только в двух образцах. Мы считаем, что это связано с малым количеством следовой ДНК на мочевых камнях. В ходе ПЦР нам также удалось оптимизировать условия реакции, повысив температуру отжига до 65°С во всех случаях и доведя время элонгации до 15 секунд.
