Перечень условных обозначений (сокращений) 4
ВВЕДЕНИЕ 4
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1. СИСТЕМАТИКА И ИДЕНТИФИКАЦИЯ
ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ 7
1.1.1. Систематика энтеробактерий 7
1.1.2. Характеристика некоторых родов семейства Enterobacteriaceae 8
1.1.3. Идентификация энтеробактерий 9
1.2. Микрообъёмная биохимическая идентификация энтеробактерий 10
1.3. Роль условно - патогенных энтеробактерий в развитии ассоциированных инфекций 12
1.4. Молекулярно - генетическая характеристика патогенного потенциала энтеробактерий 16
1.5. Этиологическая структура заболеваемости острыми кишечными инфекциями 19
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 32
2.1. Сбор коллекции клинических штаммов 32
2.2. Выделение бактериальной ДНК 32
2.3. Амплификация участков ДНК геномов микроорганизмов методом полимеразной цепной реакции 34
2.4. Электрофоретический анализ ДНК в агарозном геле 36
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 38
3.1. Анализ представленности патогенных и условно-патогенных Enterobacteriaceae в исследуемом клиническом материале 38
3.2. Сравнительный анализ генотипических и фенотипических методов определения видового состава микробиоты 47
3.3. Амплификация участков ДНК, кодирующих факторы патогенности условно - патогенных микроорганизмов 55
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 60
ВЫВОД 62
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 63
ПРИЛОЖЕНИЕ 73
Актуальность темы. Инфекционные заболевания в настоящее время широко распространены в России и за рубежом. При этом в её структуре наиболее высок удельный вес острых кишечных инфекций (ОКИ), которыми по данным ВОЗ ежегодно заболевает свыше 2 млрд человек. Особенно часто встречается дисбиоз кишечника, от которого, по данным различных исследователей, в той или иной степени страдает до 90 % населения страны [Блохина И.Н., 1999; Бондаренко В.М., 1998;
Бондаренко В.М., 2007]. В Российской Федерации, по данным
Федерального центра Госсанэпиднадзора, в 2009 году на долю детского населения приходится около 60-70 % всех случаев, регистрирующихся в разных возрастных группах эпизодов инфекционной диареи [Соболева Н.Г., 2010]. Отмечают, что частота эпизодов диареи у грудных детей колеблется от одного до трёх в течение года [Пинегин Б.В., 1984;
Самсыгина Г.А., 2003.]. Этиология диареи у грудных детей обусловлена неустойчивым микробиоценозом кишечного тракта, связанного с микробной сукцессией при формировании микробиоты, особенностями иммунной системы, неадекватным иммунным ответом организма на заселение кишечника условно-патогенными микроорганизмами [Немченко У.М., 2011]. Согласно материалам ВОЗ, в развивающихся странах у детей в возрасте младше 5 лет ежегодно возникает около 1 миллиарда эпизодов диареи. Вследствие диареи ежегодно умирает 3 миллиона детей (около 80 % из них - дети в возрасте до 2 лет). ОКИ занимают третье место в этих странах в структуре детской смертности, составляя 15 % всех ее случаев. В 2009 году заболеваемость острыми кишечными инфекциями в Республике Башкортостан составила 1043,3 на 100 тыс. населения и 8753 детей до 17 лети не имеет тенденции к снижению. Уровень лабораторной верификации ОКИ в среднем составил 6-70% по г. Уфа, а по районам республики 10¬15% [Шайхиева Г.М. и др., 2014].
Необходимо отметить, что частота распространённости кишечных инфекций напрямую связана с социально-экономическими факторами, питанием, качеством воды, климатогеографическими и иными условиями [Бондаренко В.М., 2007].
Одной из наиболее частых причин кишечных инфекций являются условно-патогенные энтеробактерии. ОКИ, вызванные условно-патогенными энтеробактериями, остаются актуальной патологией, что определяется частотой распространения, тяжестью течения, повышением лекарственной резистентностью возбудителей, изменением
этиологической структуры и степени вирулентности указанных энтеробактерий.
Целью работы является молекулярно - генетическая характеристика видового состава микробиоты кишечника и разработка ПЦР тест-систем для идентификации энтеробактерий и этиологической значимости развития в ОКИ.
Задачи исследования:
1. Бактериологическое исследование клинического материала и формирование коллекции клинических штаммов патогенных бактерий.
2. Подбор и синтез праймеров, обеспечивающих идентификацию энтеробактерий и определение «островов» патогенности.
3. Проведение ПЦР-анализа выделенной ДНК для видовой идентификации и поиска «островов» патогенности, интерпретация результатов.
4. Определение взаимосвязи между данными молекулярного анализа и особенностями клинического течения инфекции.
В ходе выполнения данной работы, нами были собраны клинические образцы у 61-го пациента со среднетяжелыми формами ОКИ. Далее из исследуемых клинических образцов, а именно испражнений, культуральным методом были выделены и исследованы штаммы условно - патогенных и патогенных микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae. Следующим этапом нашего исследования стало выделение тотальной ДНК из клинического материала, используя стандартные наборы («Рибо-Сорб», Россия). Нами были подобраны олигонуклеотидные праймеры к участкам ДНК для идентификации ряда микроорганизмов, вызывающих ОКИ. В ходе проведения ПЦР - анализа клинических материалов, выделенных от больных ОКИ, наибольшее количество раз обнаруживались Klebsiella pneumoniae, Hafnia alvei, Escherichia coli, Proteus morganii.
Сравнение фенотипических и генотипических методов идентификации микроорганизмов вопреки ожиданиям показало довольно мало совпадений. Самое большое количество совпадений определений по генотипу и фенотипу было характерно для Salmonella enteritidis и
Klebsiella pneumoniae. Hafnia alvei и Citrobacter freundii определялись только при помощи ПЦР, то есть эти бактерии являющиеся
этиологическими агентами ОКИ, видимо, вовсе не удавалось вырастить в культуре.
Для определения факторов патогенности и персистенции УПЭ нами были выбраны следующие гены: eae, hlyA, hlyB, hlyC, hlyD, ivy. Ген eae был обнаружен в образцах с ДНК E.coli. Ген ivy присутствовал в большинстве клинических образцов, принадлежащих Klebsiella pneumoniae. Также были обнаружены гены, кодирующие гемолизины (hlyA, hlyB, hlyD) были у Klebsiella pneumoniae. Эти данные могут свидетельствовать, что по крайней мере, Klebsiella pneumoniae и Escherichia coli могут обмениваться между собой генами патогенности.
Более того, обнаружение генетических детерминант служит косвенным доказательством того, что именно обнаруженные нами энтеробактерии и являются причиной острой кишечной инфекции у анализируемых больных.
