ВВЕДЕНИЕ 4
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Микрофлора кишечника 6
1.2. Нарушение микрофлоры кишечника у больных 8
1.3. Общие представления о Campylobacter spp. 10
1.4. Роль бактерий рода Campylobacter при воспалительных 13
заболеваниях кишечника
1.5. Эпидемиология 15
1.6. Индикаторы патологического процесса при заболеваниях 15
кишечника
1.7. Клинико-лабораторные методы исследований 17
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Диагностика Campylobacter spp. у больных ВЗК 21
2.2. Выделение ДНК из клинического материала 21
2.3. Амплификация участков ДНК методом полимеразной 23
цепной реакции
2.4. Анализ электрофореграммы ДНК 27
2.5. Выделение ДНК с использованием магнитных частиц 28
2.6. Проведение Real-time PCR 29
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Выделение ДНК с помощью комплекта "ДНК-сорб-С" 32
3.2. Выделение ДНК с помощью магнитных частиц 33
3.3. Подбор оптимальных условий для амплификации участков ДНК 34
3.4. Полученные результаты исследования классической ПЦР 35
3.5 Полученные результаты исследования Real-time PCR 37
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 39
ВЫВОДЫ 40
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 41
Актуальность проблемы. Одной из наиболее серьезных и нерешенных проблем в современной гастроэнтерологии и колопроктологии является Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), к которым относятся Язвенный колит (ЯК) и болезнь Крона (БК).
ВЗК представляют собой хронический воспалительный процесс, который затрагивает весь кишечник или часть желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Это приводит к болям в животе, диарее, нарушению всасывания в кишечнике.
Несмотря на то, что они уступают другим гастроэнтерологическим заболеваниям, они занимают одно из ведущих мест по тяжести течения, частоте осложнений и летальности в структуре болезней желудочно-кишечного тракта (Визе-Хрипунова, 2014).
По данным ВОЗ распространенность ВЗК колеблется в широких пределах, таким образом, для язвенного колита она составляет 30-270 случаев, а для болезни Крона 30-200 случаев на сто тысяч населения. Ежегодный прирост ЯК составляет 5-20 случаев на сто тысяч, тогда как ежегодный прирост БК составляет 3-7 случаев на сто тысяч. Смертность от воспаления кишечника, в том числе от болезни Крона и неспецифического язвенного колита, составляет примерно 1 млн. населения. В России чаще всего диагноз ставится несколько лет от момента появления первых симптомов данного заболевания.
Хотя точная этиология заболевания до сих пор не ясна (Полуэктова, 2014), считается, что в его основе лежит воспаление преимущественно аутоиммунного характера и так же активное действие различных бактериальных агентов (Дорофеев, 2014). К ним относятся антигены бактерии рода Campylobacter, которые имеют сродство с тканями слизистой оболочки тонкой и толстой кишки.
Campylobacter spp. сосредотачиваются в слизистой оболочке толстого кишечника, а в кале их концентрация очень низкая. Они практически не окрашиваются, не растут на простых питательных средах и не растут в воздушной среде.
Сочетание заболевания с различными проявлениями других симптомов вызывает разного рода трудности в его диагностике на начальных стадиях. С момента возникновения первой симптоматики до установления точного диагноза может пройти несколько месяцев и в редких случаях лет. (Langan, 2007).
Задачи исследования:
1. Сбор клинического материала (парафиновые блоки);
2. Депарафинизация биоптатов;
3. Выделение бактериальной ДНК из клинического материала
больных;
4. ПЦР анализ образцов ДНК, выделенных из клинического материала больных;
Материалы и методы:
1. Выделение ДНК из биоптатов;
2. Амплификация участков ДНК методом полимеразной цепной реакции;
3. Электрофоретический анализ ДНК в агарозном геле;
4. Амплификация участков ДНК методом ПЦР;
5. Проведение ПЦР в режиме реального времени;
Цель работы. Разработка способа выделения ДНК из биоптатов для молекулярно-генетической детекции бактерий рода Campylobacter spp. и диагностики воспалительных заболеваний кишечника.
В ходе выполнения данной работы были подобраны методы выделения и детекции бактерии рода Campylobacter из вырезов кишечника заключенных в парафин.
Для выделения ДНК из биоптатов были использованы 2 способа демаскировки. Первый способ - это выделение при помощи набора "ДНК- сорб-С",в результате которой не была детектирована ДНК бактерий рода Campylobacter. Второй способ - выделение при помощи магнитных частиц ДНК из ткани, фиксированной в формалине и заключенной в парафин, дал результат. Из исследуемых 89 образцов только 9 показали отрицательный результат. Таким образом, второй использованный метод был наиболее подходящим для выделения ДНК из биоптатов и имел больше преимуществ перед предыдущим методом: быстрый лизис ткани, отсутствие органических растворителей.
Для проведения ПЦР анализа было решено подобрать праймеры из статьи, что дало положительный результат.
Таким образом, подобран и испытан метод для детекции бактерий рода Campylobacter пригодный для применения в диагностических целях.
