Список сокращений и условных обозначений 3
ВВЕДЕНИЕ 4
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6
1.1. Микрофлора легких человека 8
1.2. Предполагаемые возбудители ХОБЛ 11
1.2.1. Факторы и механизмы вирулентности микобактерий 17
1.3. Лабораторные методы исследования хронической обструктивной болезни
легких 19
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 24
2.1. Объекты и материалы исследования 24
2.2. Методы исследования 24
2.3. Выделение ДНК 25
2.4. ПЦР-анализ препаратов ДНК клинического материала 27
2.5. Детекция ПЦР-продуктов методом агарозного гель-электрофореза 29
2.5.1. Статистический анализ 31
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 32
3.1. Подбор родоспецифичных праймеров 32
3.2. Детекция микобактерий в клиническом материале методом ПЦР 33
3.3. Исследование показателей анализа крови при ХОБЛ 41
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 49
ВЫВОДЫ 50
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 51
Актуальность проблемы. По данным Всемирной организации здравоохранения на сегодняшний день хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) занимает 4 место по смертности в мире в возрастной группе старше 45 лет, при этом смертность неуклонно растет (Чучалин, 2003; Шмелев, 2003). Данные о распространенности, болезненности и смертности от ХОБЛ заметно недооценивают общий ущерб от болезни, так как обычно ХОБЛ не распознается и не фиксируется до тех пор, пока не становится клинически значимой. Значительный рост повсеместного ущерба от ХОБЛ отражается в увеличении курения, профессиональных факторах, наследственной предрасположенности, а также изменение возрастной структуры населения (Трухан, Викторова, 2013).
Заболевание проявляется в том, что оно развивается на протяжении длительного времени и поражает человека в период наивысшей жизненной активности. На первых этапах ХОБЛ протекает без клинических проявлений, больные жалоб не имеют (Чучалин, 2003; Шмелев, 2003).
Доказано, что наиболее частыми причинами обострений ХОБЛ являются бактериальные и вирусные респираторные инфекции и загрязняющие вещества в атмосферном воздухе, однако причиной примерно 20-30% случаев обострений установить не удается. (White, et al., 2003; Veeramachaneni, Sethi, 2006; Papi et al, 2006). Среди бактерий при обострении ХОБЛ обнаруживаются нетипируемые Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae и Moraxella catarrhalis, энтеробактерии и Pseudomonas aeruginosa. Но в последнее время исследование нетуберкулезных микобактерий показало их этиологическую значимость (Sethi et al., 2002; Veeramachaneni, Sethi, 2006; Авдеев, 2009).
Род микобактерий насчитывает более 50 видов и подвидов микобактерий (Оттен, Васильев, 2005; Отева, Полонская, 2013).
Считается, что большинство пациентов заражаются нетуберкулезными микобактериями из окружающей среды, но механизм их поступления в организм точно не известен, при этом нетуберкулезные микобактерии могут играть важную роль в возникновении респираторных заболеваний (Falkinham, 2002; Falkinham, 2003; Отева, Полонская, 2013).
Микобактериозы легких получили в последние годы известность в связи с улучшением лабораторных методов выделения и идентификации нетуберкулезных микобактерий. Диагностика микобактериоза остается сложной проблемой, так как большая часть нетуберкулезных микобактерий является условно-патогенной и до настоящего времени не разработаны методы постановки диагноза и подходы к лечению этого заболевания (Литвинов и др., 2008; Суркова и др., 2015).
Цель исследования
Совершенствование методологии ПЦР-детекции нетуберкулезных микобактерий в клиническом материале и экспериментальная оценка частоты их встречаемости при ХОБЛ.
Задачи исследования
1. Сбор клинического материала (мокроты).
2. Выделение ДНК с помощью набора «АмплиПрайм ДНК-сорб-АМ».
3. Амплификация ДНК с родоспецифичными праймерами.
4. Анализ частоты встречаемости микобактерий при ХОБЛ и сравнение с другими диагнозами.
Практическая значимость
На основании проведенных исследований предложена тест-система, обеспечивающая лабораторную детекцию нетуберкулезных микобактерий при ХОБЛ на ранних стадиях заболевания, при которых детекция возбудителя обычными методами проблематична. Проведена сравнительная характеристика информативности разработанной тест-системы для обнаружения нетуберкулезных микобактерий в клиническом материале.
Исследование ДНК, выделенной из образцов клинического материала (мокроты), показало, что ПЦР-анализ является высокоспецифичными и чувствительными, что является важным фактором при лабораторной диагностике, а подобранные родоспецифичные праймеры действительно обладают высокой специфичностью и могут применятся при исследовании клинического материала на наличие бактерий рода Mycobacterium.
Как было показано, при диагностике микобактериозов нельзя опираться на данные показателей крови, так как статистически значимой разницы между значениями у пациентов с патологиями дыхательных путей нет. Кроме того, все эти показатели практически находились в пределах нормы.
ПЦР - диагностика при ХОБЛ обладает рядом преимуществ: высокой и регулируемой специфичностью, высокой чувствительностью, возможностью идентификации возбудителя в течение нескольких часов, не требует специальных условий доставки и хранения материала.
