Селекция аутоштаммов Lactobacillus spp. с выраженной антагонистической активностью при использовании бактериофагов
|
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1. Lactobacillus 7
1.2. Пробиотики 12
1.3. Бактериофаги 15
1.4. Аутокультуры 20
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 22
2.1. Взятие материала 22
2.2. Приготовление питательной среды 23
2.3. Посев бактерий в жидкую питательную среду 25
2.4. Приготовление разведений для определения исходной концентрации в
клиническом материале 25
2.5. Создание анаэробных условий 26
2.6. Окраска по Граму 27
2.7. Метод перпендикулярных штрихов 29
2.8. Титрование фага методом агаровых слоев 30
2.8.1. Метод титрования бактериофага по Аппельману (на жидкой
питательной среде) 30
2.8.2. Метод титрования бактериофага по Грациа (на плотной питательной
среде) 30
2.9. Выделение ДНК 31
2.10. ПЦР в режиме реального времени 33
2.11. Ранговая статистика 35
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.. .37
3.1. Титрование бактериофага 37
3.2. Анализ устойчивости чистой культуры Lactobacillus spp. к действию
Пиобактериофага в жидкой питательной среде 40
3.3. Анализ устойчивости чистой культуры Lactobacillus spp. к действию
Пиобактериофага на плотной питательной среде 43
3.4. Определение исходной концентрации Lactobacillus spp.
в клиническом материале 45
3.5. Получение накопительных культур 47
3.6. Сравнение конечной концентрации Lactobacillus spp. в образцах с и без
Пиобактериофаг 48
3.7. Анализ активности Пиобактериофага по отношению к штаммам
Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Streptococcus spp., Enterococcus faecium....56
3.8. Выделение чистой культуры бактерий Lactobacillus spp. из
накопительных культур 60
3.9. Идентификация исследуемых образцов до рода 63
3.10. Оценка антагонистической активности 72
3.11. Идентификация исследуемых образцов до вида 80
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 85
ВЫВОДЫ 88
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 89
ПРИЛОЖЕНИЕ 96
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1. Lactobacillus 7
1.2. Пробиотики 12
1.3. Бактериофаги 15
1.4. Аутокультуры 20
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 22
2.1. Взятие материала 22
2.2. Приготовление питательной среды 23
2.3. Посев бактерий в жидкую питательную среду 25
2.4. Приготовление разведений для определения исходной концентрации в
клиническом материале 25
2.5. Создание анаэробных условий 26
2.6. Окраска по Граму 27
2.7. Метод перпендикулярных штрихов 29
2.8. Титрование фага методом агаровых слоев 30
2.8.1. Метод титрования бактериофага по Аппельману (на жидкой
питательной среде) 30
2.8.2. Метод титрования бактериофага по Грациа (на плотной питательной
среде) 30
2.9. Выделение ДНК 31
2.10. ПЦР в режиме реального времени 33
2.11. Ранговая статистика 35
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.. .37
3.1. Титрование бактериофага 37
3.2. Анализ устойчивости чистой культуры Lactobacillus spp. к действию
Пиобактериофага в жидкой питательной среде 40
3.3. Анализ устойчивости чистой культуры Lactobacillus spp. к действию
Пиобактериофага на плотной питательной среде 43
3.4. Определение исходной концентрации Lactobacillus spp.
в клиническом материале 45
3.5. Получение накопительных культур 47
3.6. Сравнение конечной концентрации Lactobacillus spp. в образцах с и без
Пиобактериофаг 48
3.7. Анализ активности Пиобактериофага по отношению к штаммам
Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Streptococcus spp., Enterococcus faecium....56
3.8. Выделение чистой культуры бактерий Lactobacillus spp. из
накопительных культур 60
3.9. Идентификация исследуемых образцов до рода 63
3.10. Оценка антагонистической активности 72
3.11. Идентификация исследуемых образцов до вида 80
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 85
ВЫВОДЫ 88
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 89
ПРИЛОЖЕНИЕ 96
Актуальность проблемы
В современной бактериологической лаборатории исследование трудно культивируемых микроорганизмов по-прежнему остается одной из наиболее актуальных проблем.
Представители рода Lactobacillus являются облигатными анаэробами, имеющие сложные пищевые потребности в аминокислотах, витаминах, пептидах, индивидуальные для каждого вида, что усложняет задачу их культивирования на простых питательных средах [Воробьева А.А. и др.,2006].
Другой задачей является идентификация бактерий, полученных из клинического материала и выращенных на питательных средах. До недавнего времени подтверждение видовой принадлежности Lactobacillus осуществлялась на основе изучения морфологических, физиологических и биохимических признаков, что не всегда эффективно, особенно при работе со смешанными культурами [Кузнецова Т.В. и др.,2016].
На сегодняшний день одним из наиболее точных методов идентификации штаммов Lactobacillus является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) [Кузнецова Т.В. и др.,2016]. Но он не дает возможности получения чистых культур микроорганизмов, а только несет в себе информацию о качестве и количестве микробного агента.
В наши дни применение бактериофагов стало парадигмой лечебного и профилактического направления в медицине при терапии гнойно¬воспалительных заболеваний различной локализации у детей и взрослых [Бондаренко В.М.,2005]. Диапазон способов применение бактериофагов необычайно широк, а использование их в качестве селективных агентов в клинической практике позволит значительно расширить его.
Цель исследования
Селекция аутоштаммов Lactobacillus spp. с выраженной
антогонистической активностью при использовании бактериофагов для разработки новых методик посева клинического материала на питательные среды, позволяющих значительно сократить продолжительность исследования в бактериологичесих лабораториях.
Задачи исследования
1. Воздействие на культуры штаммов представителей рода Lactobacillus бактериофагом.
2. Бактериологическая характеристика полученных культур рода Lactobacillus и определение их антагонистической активности.
3. Применение методики ускоренного получения чистых культур представителей рода Lactobacillus с последующим созданием коллекции кандидатов в пробиотики.
Научная новизна
Предложена селекция аутоштаммов Lactobacillus spp. с выраженной антагонистической активностью при использовании бактериофагов . Персонализация лечения больших групп населения при помощи модернизации аутоштамма нормофлоры Lactobacillus spp. является новейшим направлением безинвазивной медицины.
Практическая значимость
Разработка новых способов культивирования Lactobacillus spp. позволит сократить время и затраты на преданалитическом этапе исследований в бактериологической лаборатории. Использование бактериофагов в качестве селективного агента значительно ускоряет процесс отбора кандидатов для будущих пробиотиов.
В современной бактериологической лаборатории исследование трудно культивируемых микроорганизмов по-прежнему остается одной из наиболее актуальных проблем.
Представители рода Lactobacillus являются облигатными анаэробами, имеющие сложные пищевые потребности в аминокислотах, витаминах, пептидах, индивидуальные для каждого вида, что усложняет задачу их культивирования на простых питательных средах [Воробьева А.А. и др.,2006].
Другой задачей является идентификация бактерий, полученных из клинического материала и выращенных на питательных средах. До недавнего времени подтверждение видовой принадлежности Lactobacillus осуществлялась на основе изучения морфологических, физиологических и биохимических признаков, что не всегда эффективно, особенно при работе со смешанными культурами [Кузнецова Т.В. и др.,2016].
На сегодняшний день одним из наиболее точных методов идентификации штаммов Lactobacillus является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) [Кузнецова Т.В. и др.,2016]. Но он не дает возможности получения чистых культур микроорганизмов, а только несет в себе информацию о качестве и количестве микробного агента.
В наши дни применение бактериофагов стало парадигмой лечебного и профилактического направления в медицине при терапии гнойно¬воспалительных заболеваний различной локализации у детей и взрослых [Бондаренко В.М.,2005]. Диапазон способов применение бактериофагов необычайно широк, а использование их в качестве селективных агентов в клинической практике позволит значительно расширить его.
Цель исследования
Селекция аутоштаммов Lactobacillus spp. с выраженной
антогонистической активностью при использовании бактериофагов для разработки новых методик посева клинического материала на питательные среды, позволяющих значительно сократить продолжительность исследования в бактериологичесих лабораториях.
Задачи исследования
1. Воздействие на культуры штаммов представителей рода Lactobacillus бактериофагом.
2. Бактериологическая характеристика полученных культур рода Lactobacillus и определение их антагонистической активности.
3. Применение методики ускоренного получения чистых культур представителей рода Lactobacillus с последующим созданием коллекции кандидатов в пробиотики.
Научная новизна
Предложена селекция аутоштаммов Lactobacillus spp. с выраженной антагонистической активностью при использовании бактериофагов . Персонализация лечения больших групп населения при помощи модернизации аутоштамма нормофлоры Lactobacillus spp. является новейшим направлением безинвазивной медицины.
Практическая значимость
Разработка новых способов культивирования Lactobacillus spp. позволит сократить время и затраты на преданалитическом этапе исследований в бактериологической лаборатории. Использование бактериофагов в качестве селективного агента значительно ускоряет процесс отбора кандидатов для будущих пробиотиов.
Организм человека является открытой системой, обладающей способностью поддерживать комплексное постоянство своего состава и свойств внутренней среды. Сохранять устойчивость основных физиологических функций живого организма удается посредством скоординированных реакций, направленных на поддержание динамического равновесия. Одной из частей этого гомеостаза представляет собой микрофлора, состоящая из множества микробиоценозов, характеризующихся определенным составом и занимающих
соответствующее место в организме человека. Нормальная микрофлора кишечника и влагалища на 99% состоит из анаэробных видов бактерий. Господствующие место принадлежит представителям семейства Lactobacillaceae. Каждый локус человеческого организма отличается количественным и качественным составом микроорганизмов, это является гарантом здоровья человека. Даже несущественное изменение какого-либо звена микрофлоры, зачастую сопровождается и нарушениями соответствующих функций, что может привести к заболеванию.
Нарушение биологического равновесия между патогенной и физиологической микрофлорой, в медицинской практике принято называть: дисбактериозом, дисбиозом, микробиологическим дисбалансом или дисбиотическим состоянием. Терминология этих определений весьма обширна, однако неизменным остается то, что это вторичные состояния, характеризующееся как местными, так и общими нарушениями, которые способствуют более тяжелому течению основного заболевания.
Несмотря на то, что для характеристики биотопов с высокой степенью обсемененности используются различные методы, эталоном остается бактериологический анализ. Но при этом не стоит забывать, что ручная стандартная фенотипическая идентификация бактерий сложна и не соответствует современным потребностям клинической лаборатории.
Современные реалии подчеркивают необходимость, применения молекулярных методов идентификации представителей рода Lactobacillus. До начала таксономических исследований необходимо выделить чистую культуру. Данный процесс является трудоемким, продолжительным по времени, несет в себе высокие коммерческие издержки.
Разработка новых способов культивирования культур рода Lactobacillus позволит сократить время и затраты на преданалитическом этапе. Перспективной представляется селекция аутоштамов при помощи бактериофагов, как фактора, способствующего наилучшему развитию лактобацилл.
Полученные в данной работе результаты подчеркивают эффективность использования фагов в качестве селективных агентов.
В ходе экспериментальной работы при использовании бактериофагов проведено выделение чистых культур микроорганизмов из накопительных культур на плотной питательной среде и выделение чистых культур Lactobacillus spp. из накопительных культур в жидкой питательной среде. Методом ПЦР в режиме реального времени была определена принадлежность культур к роду Lactobacillus а также их видовое положение.
Одной из главных задач было получение антагонистически активных штаммов рода Lactobacillus. Для оценки антагонистической активности использовались микроорганизмы с положительным результатом ПЦР на принадлежности к роду Lactobacillus. Метод перпендикулярных штрихов позволил проверить антагонистическую активность конкретных представителей рода Lactobacillus.
В ходе проведения работы создана коллекция клинических штаммов бактерий рода Lactobacillus, обладающих высокой антагонистической активностью
Практический выход данной работы заключался в разработке методологии использования бактериофага в качестве селективного агента при культивировании рода Lactobacillus.
соответствующее место в организме человека. Нормальная микрофлора кишечника и влагалища на 99% состоит из анаэробных видов бактерий. Господствующие место принадлежит представителям семейства Lactobacillaceae. Каждый локус человеческого организма отличается количественным и качественным составом микроорганизмов, это является гарантом здоровья человека. Даже несущественное изменение какого-либо звена микрофлоры, зачастую сопровождается и нарушениями соответствующих функций, что может привести к заболеванию.
Нарушение биологического равновесия между патогенной и физиологической микрофлорой, в медицинской практике принято называть: дисбактериозом, дисбиозом, микробиологическим дисбалансом или дисбиотическим состоянием. Терминология этих определений весьма обширна, однако неизменным остается то, что это вторичные состояния, характеризующееся как местными, так и общими нарушениями, которые способствуют более тяжелому течению основного заболевания.
Несмотря на то, что для характеристики биотопов с высокой степенью обсемененности используются различные методы, эталоном остается бактериологический анализ. Но при этом не стоит забывать, что ручная стандартная фенотипическая идентификация бактерий сложна и не соответствует современным потребностям клинической лаборатории.
Современные реалии подчеркивают необходимость, применения молекулярных методов идентификации представителей рода Lactobacillus. До начала таксономических исследований необходимо выделить чистую культуру. Данный процесс является трудоемким, продолжительным по времени, несет в себе высокие коммерческие издержки.
Разработка новых способов культивирования культур рода Lactobacillus позволит сократить время и затраты на преданалитическом этапе. Перспективной представляется селекция аутоштамов при помощи бактериофагов, как фактора, способствующего наилучшему развитию лактобацилл.
Полученные в данной работе результаты подчеркивают эффективность использования фагов в качестве селективных агентов.
В ходе экспериментальной работы при использовании бактериофагов проведено выделение чистых культур микроорганизмов из накопительных культур на плотной питательной среде и выделение чистых культур Lactobacillus spp. из накопительных культур в жидкой питательной среде. Методом ПЦР в режиме реального времени была определена принадлежность культур к роду Lactobacillus а также их видовое положение.
Одной из главных задач было получение антагонистически активных штаммов рода Lactobacillus. Для оценки антагонистической активности использовались микроорганизмы с положительным результатом ПЦР на принадлежности к роду Lactobacillus. Метод перпендикулярных штрихов позволил проверить антагонистическую активность конкретных представителей рода Lactobacillus.
В ходе проведения работы создана коллекция клинических штаммов бактерий рода Lactobacillus, обладающих высокой антагонистической активностью
Практический выход данной работы заключался в разработке методологии использования бактериофага в качестве селективного агента при культивировании рода Lactobacillus.
