ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. Эпидемиология 8
1.2. Лечение онихомикозов 10
1.3. Классификация 11
1.4. Этиология 13
1.5. Диагностика 17
1.5.1. Микроскопия материала 19
1.5.2. Культуральное исследование 21
1.5.3 Молекулярно-биологические методы 24
1.5.4 Гистологическое исследование 26
1.5.5. Иммунологические методы 27
1.5.6. Инструментальные методы 27
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 29
2.1. Взятие материала 29
2.2. Микроскопическое исследование 29
2.4. Выделение ДНК 32
2.4.1. Выделение при помощи 2-4М растворов щелочи 32
2.4.2. Выделение при помощи набора «Реамикс» фирмы НПФ «Гентех» 34
2.4.3. Выделение при помощи набора «ДНК-сорб С» фирмы
«ИнтерЛабСервис» 34
2.4.4. Выделение препаратов ДНК грибов из клинического материала
методом нуклеосорбции 35
2.4.4. Выделение ДНК проводят с использованием стандартного набора
«ДНК-сорб-С» фирмы «Интерлабсервис» 35
2.4.5. Выделение с помощью набора «ДНК-сорб С» из образцов
предварительно обработанных стеклянным порошком 37
2.5. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 38
2.6. Электрофорез 41
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 44
3.1. Микроскопическое исследование 44
3.2. Культуральное исследование 48
3.3. Результаты ПЦР 54
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 61
ВЫВОДЫ 62
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 63
ПРИЛОЖЕНИЕ 70
Актуальность темы исследования
Онихомикоз - грибковое поражения ногтя, вызываемое различными видами патогенных грибков. При этом поражаются ногтевые структуры, такие как, ногтевая пластина, кутикула, мезенхимальные ткани, ногтевые складки. Также грибковая инфекция может поражать ногтевые структуры по отдельности [Haley L., Daniel CR., 1990]. Практически всегда грибковое
заболевание начинается между пальцев рук или ног, а затем уже переходит на ногтевую пластину. Онихомикозами страдают от 5 до 10% от всего населения.
Возбудителями онихомикозов являются первично патогенные кератофильные грибы - дерматомицеты. Также заболевание могут вызывать дрожжевые и плесневые грибы [Bonifaz A., Cruz-Agular P., 2007]. Основными возбудителями являются Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes var. interdigitale. Trichophyton rubrum - антропофильный грибок, т.е. человек является естественным резервуаром [Файзуллина Е. В., 2014].
Классические методы диагностики онихомикозов, основанные на микроскопии патологического материала и выделении культуры возбудителя, достаточно трудоемки, требуют значительных временных затрат, отличаются невысокой чувствительностью. По данным отечественных и зарубежных исследователей чувствительность культурального метода составляет около 50 % [Лещенко В.М., 2006, Сергеев А.Ю., 2006].
Микроскопия позволяет проводить дифференциальную диагностику видов онихомикоза по морфологии спор и нитей. Однако такой способ не точен на начальной стадии и при запущенной форме заболевания.
Культуральный метод является «золотым стандартом» в микологии. При этом проводится выращивание грибов на специальных микробиологических средах. Идентификация производится по виду колонии и по чистой культуре при ее микроскопировании. Недостаток такого способа заключается в долгом росте грибка.
Но ни один из классических методов не позволяет точно и быстро идентифицировать возбудителей онихомикоза.
В связи с этим, перспективным направлением в лабораторной диагностике онихомикозов представляется обнаружение генетических маркеров возбудителей с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Цель исследования
Выявление эффективности известных наборов для выделения ДНК патогенных грибов и сравнение их с другими модифицированными методами с целью разработки более усовершенствованного способа диагностики онихомикозов.
Задачи исследования
1. Выделение ДНК грибов при помощи:
- Набора «Реамикс» фирмы «ТрифАМ»;
-Набора «ДНК-Сорб-С» фирмы «ИнтерлабСервис»;
- Химический метод с использованием 2 М, 3 М, 4 М растворов щелочи КОН;
-Выделение с помощью набора «ДНК-сорб С» из образцов предварительно обработанных стеклянным порошком.
2. Проведение амплификации всех выделенных образцов при помощи набора «ТрифАМ» который предназначен для детекции двух дерматомицетов - Trichophyton rubrum и T.mentagrophytes var. interdigitale.
3. Выявление оптимальной методики посредством сравнения выхода продуктов ПЦР.
Научная новизна
Использование стандартных схем для получения ДНК и новых модифицированных методов с варьированием различных условий с целью разработки более эффективных методов позволят определить наиболее удобные схемы выделения ДНК.
Теоритическая и практическая значимость
Совершенствование способов диагностики онихомикозов весьма актуально в связи с высокой частотой заболеваемости среди населения всех возрастных групп. Стандартные схемы и модифицированные методики позволят определить более эффективные пути выделения ДНК грибов.
Материал исследования
Материалом исследования послужил биологический материал - ногтевые пластинки пациентов больных онихомикозом Республиканского кожно¬венерологического диспансера г.Уфы.
Проблема диагностики онихомикозов весьма актуальна в связи с высокой частотой заболеваемости среди населения всех возрастных групп. Необходимость дифференциальной диагностики и идентификации грибковых поражений ногтей приобретает особую важность в целях своевременного начала лечения.
В настоящее время применяются различные способы диагностики грибковых заболеваний. Внедрение новых методов, претендующих на роль золотого стандарта в диагностике онихомикозов, требует тщательной оценки таких показателей как: точность, чувствительность и специфичность. Перспективным направлением в лабораторной диагностике онихомикозов представляется обнаружение генетических маркеров возбудителей с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Выделение набором «Реамикс» фирмы «ГЕНТЕХ» показало высокий результат чувствительности, который составил 85%. Это значительно выше чувствительности аналогичных ПЦР систем.
Чувствительность выделение набором «ДНК-сорб С» фирмы
«ИнтерЛабСервис» оказалась ниже чем у предыдущего и составила 70 %.
Выделение ДНК 2М раствором щелочи не дало результатов, зато при использовании 3М раствора щелочи чувствительность составила 20%, а при выделении 4М раствором щелочи чувствительность соответствовала 60%.
К сожалению, выделение ДНК патогенных грибов из образцов предварительно обработанных стеклянным порошком для разрушения клеток грибов не дало результатов.
По частоте положительных результатов лучше всего выделение ДНК прошло при помощи наборов «Реамикс», «ДНК-сорб С» и 4М раствором щелочи.
