Список сокращений и условных обозначений 3
ВВЕДЕНИЕ 4
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1. Микробиота кишечника 7
1.2. Нарушение микробиоценоза при ВЗК 9
1.3. Воспалительные заболевания кишечника 11
1.4. Общие представления о бактериях рода Campylobacter 13
1.5. Эпидемиология 16
1.6. Маркеры кишечного воспаления при заболеваниях кишечника 17
1.7. Диагностика кампилобактерий 19
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 23
2.1. Клиническое и лабораторное обследование больных 23
2.2. Депарафинизация и выделение ДНК из биоптатов 23
2.3. Выделение ДНК из биоптатов набором «ДНК-сорб-С» 25
2.4. Выделение ДНК из кала 27
2.5. Праймеры, использованные в исследовании 29
2.6. Амплификация участков ДНК методом полимеразной цепной 31
реакции
2.7. Электрофоретический анализ ДНК в агарозном геле 36
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 38
3.1. Выделение ДНК 38
3.2. Праймеры для амплификации бактерий рода Campylobacter 39
3.3. ПЦР-анализ с ДНК, выделенной из биоптатов 40
3.4. ПЦР-анализ с ДНК, выделенной из кала 42
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 44
ВЫВОДЫ 45
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 46
Актуальность. Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) по уровню распространенности и заболеваемости значительно уступают другим заболеваниям внутренних органов. Однако по тяжести течения, частоте осложнений, инвалидизации и летальности они занимают одно из ведущих мест во всем мире в структуре заболеваний органов пищеварения. К ним относятся неспецифический язвенный колит и болезнь Крона.
Язвенный колит — хроническое заболевание, характеризующееся непрерывным воспалением слизистой оболочки толстого кишечника при отсутствии гранулем в биопсийном материале с поражением прямой кишки и различным по протяженности поражением толстой кишки, имеющее рецидивное и ремиттирующее течение.
Болезнь Крона — гранулематозное воспаление кишки, характеризующееся развитием ее стеноза, образованием свищей и внекишечными проявлениями. Регионарные поражения могут возникать в любых отделах ЖКТ (Хруцкая, Панкратова, 2013).
ВЗК - патология индустриально развитых стран, и главным образом городского населения. Заболевания поражают преимущественно молодых людей (средний возраст заболевших - 20-40 лет), но могут начинаться в любом возрасте (Белоусова, 2002).
Воспалительные заболевания кишечника вызываются вирусами, простейшими или бактериями. Наиболее частыми возбудителями являются Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis, Escherichia coli, Campylobacter jejuni, C. fetus, бактерии рода Salmonella и Shigella. При надлежащей диагностике кампилобактеры обнаруживаются в трети случаев (Flint et al., 2005).
Особенностью заболеваемости в нашей стране является троекратное преобладание тяжелых осложненных форм ВЗК с высокой летальностью, что
связано с поздней диагностикой. При гистологическом исследовании биопсийного и аутопсийного материала трудно отличить от проявлений бактериальных инфекций - сальмонеллеза и шигеллеза.
Кампилобактеры, вызывающие патологию, обладают различными антигенными особенностями, вирулентностью, богатым спектром патогенности. Campylobacter — это один из видов микроорганизмов, способных к инвазивности, продуцирующий цитотоксические токсины, и до настоящего времени антигенная структура и роль Campylobacter недостаточно изучена.
В настоящее время для диагностики кампилобактериоза используют «золотой стандарт» - выделение и идентитфикация чистых культур. Однако, кампилобактерии микроаэрофилы, растут на сложных питательных средах, требуют высокой квалификации персонала. Диагностика усложняется разнообразием клинических проявлений кампилобактериоза. Все это приводит к недооценке истинной картины распространенности кампилобактериоза в структуре инфекционных заболеваний. Внедрение ПЦР-тестов в диагностичеких лабораториях может упростить и повысить эффективность диагностики кампилобактериозных инфекций (Шевцов и др., 2014).
Цель исследования. Разработка тест-системы для выявления Campylobacter spp. в клиническом материале у пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника и оценка ее эффективности.
Задачи исследования
1. Сбор клинического материала.
2. Выделение ДНК из биоптатов кишечника у пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника.
3. Выбор родоспецифических праймеров при молекулярно-генетической идентификации.
4. Подбор оптимального метода генетической идентификации.
5. Сравнение результатов молекулярно-генетической детекции ДНК биоптатов с ДНК различных клинических материалов.
Научная новизна. Данная тест-система будет использоваться для выявления бактерий рода Campylobacter при воспалительных заболеваниях кишечника.
Практическая значимость. Предложенный подход позволит разработать оптимальный метод и наборы реагентов для пробоподготовки и ПЦР обнаружения Campylobacter spp. непосредственно в биоптатах, получаемых для гистологического исследования. Высокая аналитическая чувствительность и специфичность ПЦР тест-системы для выявления кампилобактерий позволяют использовать разработанный тест в экспресс- диагностике кампилобактериоза.
Область применения результатов исследования. Разработанная в ходе исследования методика демаскировки биоптатов может быть широко использована, так как не требует дорогих реактивов и не занимает много времени. Детекция бактерий рода Campylobacter может стать основой при постановке диагноза и дальнейшего лечения больных. Результаты проделанной работы могут быть применимы в медицине, лабораторной диагностике для выявления кампилобактерий и при назначении висмутсодержащих препаратов против них.
ВЗК является одной из сложнейших проблем гастроэнтерологии из-за тяжести течения, инвалидизации и летальности. Этиологическую роль играют воспаления аутоиммунного характера и различные бактериальные агенты.
Методом ПЦР был проанализирован клинический материал (кал) 54¬х пациентов на наличие кампилобактерий и 41 образец биоптатов. При этом в клинических образцах, выделенных их фекалий ДНК бактерий рода Campylobacter не были обнаружены. В результате проведения ПЦР с ДНК исследованных проб биоптатов во всех случаях были получены положительные результаты, свидетельствующие о наличии в них искомых бактерий рода Campylobacter.
Для выделения ДНК из биоптатов использовали депарафинизацию и оптимизировали метод выделения ДНК из ткани, фиксированной в формалине и заключенной в парафин, который дал результат. Использованный метод был наиболее подходящим для выделения ДНК из биоптатов и имел больше преимуществ: быстрый лизис ткани, отсутствие органических растворителей и в несколько раз ниже стоимость, что позволяет рекомендовать его для широкой клинико-лабораторной практики.
Таким образом, были испытаны две пары праймеров, которые доказали наличие бактерий рода Campylobacter в биоптатах при ВЗК в 100% случаях и пригодные для дальнейшего использования на практике для идентификации методом ПЦР.
