РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ ОЦЕНКИ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ШТАММОВ - КАНДИДАТОВ В ПРОБИОТИКИ

ВВЕДЕНИЕ 4
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1. Современные представления о пробиотиках 7
1.2. Пробиотики в лечении инфекций влагалища 9
1.3. Методы оценки антагонистической активности 17
1.4. Анаэробные микроорганизмы и биопленки 21
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 28
2.1. Взятие материала 28
2.2. Выделение чистых культур условно-патогенных микроорганизмов.29
2.3. Бактериоскопическое исследование микроорганизмов 29
2.4. Идентификация по биохимическим признакам 30
2.5. Определение антагонистической активности 32
2.6. Исследование адгезивности пробиотических бактерий 34
2.7. Выделение ДНК 35
2.8. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени 37
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ... 39
3.1. Выделение чистых культур условно-патогенных микроорганизмов и
лактобактерий 39
3.2. Микроскопическое исследование микроорганизмов 51
3.3. Результаты идентификации по биохимическим признакам 54
3.4. Оценка антагонистической активности лактобактерий 57
3.5. Исследование адгезии лактобактерий и УПМ к клеткам Hela 59
3.6. Оценка активности лактобактерий в отношении Atopobium vaginae на
клеточных культурах по способности пробиотиков разрушать биопленку и адгезироваться на поверхности 61
ВЫВОДЫ 66
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 67
ПРИЛОЖЕНИЕ 76

Купить

Актуальность проблемы
Значительное распространение бактериального вагиноза (БВ), сопровождающихся значительными нарушениями микробиоценоза (главным образом снижением общего количества лактобактерий), предопределило поиск новых альтернативных методов их лечения.
В настоящее время известно много различных пробиотиков. Их основу составляют живые культуры представителей нормальной микрофлоры человека. Эффективность препаратов в первую очередь зависит от входящих в их состав штаммов лактобактерий.
Впервые использовал вагинальный пробиотик Stanley Thomas в 1928 г. после того, как провел исследование и выявил, что лактобактерии отсутствовали в среде с гонококками. Он сослался на два опыта - один, проведенный в пробирке, а другой в естественных условиях - в которых добавление малого количества сыворотки L. acidophilus уничтожало Neisseria gonorrhoeae. Было предложено использовать для восстановления нормальной вагинальной микрофлоры экзогенные штаммы лактобактерий. Использование пробиотических штаммов Lactobacillus fermentum и Lactobacillus rhamnosi при лечение урогенитальных инфекций имело слабые результаты, возможно потому что в обычной флоре они не распространены. Лучше применять L. crispatus в подобной ситуации, потому что она доминирует в здоровой вагинальной микрофлоре, и 95% штаммов производят H2O2. Lactobacillus crispatus может дольше выживать в вагинальной флоре.
Традиционно активность пробиотических бактерий в отношении клинических изолятов (Staphylococcus aureus, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei, Bacillus subtilis) определяется методом отсроченного антагонизма на питательной среде.
Благодаря развитию молекулярно-генетических методов обнаружены анаэробные микроорганизмы: Atopobium vaginae, Leptotrichia amnionii, Sneathia sanguinegens и Eggerthella spp., против которых не проверялась антагонистическая активность.
Поведение микроорганизмов in vitro и in vivo отличается, тем более что данные микроорганизмы образуют биопленку на поверхности эпителия влагалища, что невозможно увидеть на питательной среде. Поэтому необходима разработка нового метода оценки антагонистической эффективности пробиотиков на культурах клеток против анаэробных микроорганизмов. Данный метод позволит контролировать образование биопленки, производство Н2О2 и молочной кислоты, выживание лактобактерий на эпителии влагалища.
Цель исследования
Оценка антагонистической активности лактобактерий по спектру и уровню антагонистической активности к условно-патогенным штаммам бактерий.
Задачи исследования
1. Получение чистых культур штаммов пробиотиков, наиболее часто использующихся для лечения БВ, и условно-патогенных микроорганизмов;
2. Оценка активности пробиотических бактерий в отношении условно-патогенных микроорганизмов методом отсроченного антагонизма на питательной среде;
3. Определение способности лакто- и условно-патогенных анаэробных бактерий образовывать биопленку;
4. Оценка активности пробиотических бактерий в отношении анаэробных микроорганизмов на клеточных культурах по способности пробиотиков разрушать биопленку и адгезироваться на поверхности.
Научная новизна.
Проведена оценка антагонистической эффективности штаммов- кандидатов в пробиотики Lactobacillus crispatus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum в отношении условно-патогенных микроорганизмов Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Gardnerella vaginalis, , Atopobium vagina.
Практическая значимость.
Полученные данные позволят оптимизировать и индивидуализировать лечение БВ. Результаты работы могут быть применены в медицине, в практическом здравоохранении, в клинико-диагностических лабораториях государственных лечебных учреждений, лабораториях научно-исследовательских центров и ВУЗов.
Купить