Разработка прецизионной технологии количественной оценки антибактериальной активности новых химических соединений в отношении грамотрицательных бактерий

Список сокращений и условных обозначений
ВВЕДЕНИЕ 5
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1. Инфекционные заболевания, вызванные грамотрицательными бактериями 9
1.2. Pseudomonas aeruginosa общая микробиологическая характеристика 11
1.3. Pseudomonas aeruginosa: вирулентность и ее регуляция 13
1.4. Антибиотики с выраженной активностью в отношении грамотрицательных бактерий 18
1.5. Методы определения чувствительности к антимикробным препаратам 23
1.5.1. Методы серийных разведений 23
1.5.1.1. Метод серийных разведений в бульоне 26
1.5.1.2. Метод серийных разведений в агаре 28
1.5.2. Диско-диффузионный метод (ДДМ) 31
1.5.3. Е-тест (эпсилометрический метод) 35
1.5.4. Метод пограничных концентраций 36
1.5.5. Молекулярно-генетические методы: полимеразная цепная реакция (ПЦР) 36
1.5.5.1. Стандартная ПЦР 37
1.5.5.2. ПЦР в режиме реального времени (РТ-ПЦР) 39
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 41
2.1. Объекты исследования 41
2.2. Приготовление питательных сред для культивирования Pseudomonas aeruginosa 41
2.3. Конструирование положительного образца 45
2.4. Выделение бактериальной ДНК из выросших колоний 45
2.5. Проведение стандартной полимеразно цепной реакции (ПЦР) 46
2.6. Электрофоретическая детекция продуктов амплификации 47
2.7. Проведение ПЦР в режиме реального времени (РТ-ПЦР) 49
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 51
3.1. Конструирование калибратора для количественной оценки содержания
Pseudomonas aeruginosa 51
3.2. Определение величины минимальной подавляющей концентрации (МИК) исследуемых антибиотиков 56
3.3. Экспериментальная оценка сконструированного калибратора на антибактериальных препаратах
3.4. Разработка системы интерпретации результатов молекулярно-генетического анализа антибактериальной активности препаратов
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ
Купить

Актуальность. Инфекционные болезни на протяжении многих столетий были и остаются наиболее опасными болезнями человеческого организма из-за их способности вовлечь в процесс большое число здоровых людей в течение короткого периода времени. По данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) 2013 г. в Российской Федерации зарегистрировано более 33 млн 225 тыс. инфекционных заболеваний (в 2012 г. - 31 млн 477 тыс.). В 2013 г. в России умерло 1,9 млн человек, от инфекционных болезней - 31 808 (1,7%), зарегистрировано 33 млн 255 тыс. случаев инфекционных болезней, летальный исход составил - 0,096%. С каждым годом число больных, страдающих инфекционными заболеваниями, увеличивается и не имеет тенденции к снижению. В связи этим встает вопрос о необходимости совершенствования методик быстрого выявления возбудителя и точного определения его чувствительности к лекарственным препаратам, что в свою очередь, необходимо для выбора адекватной антибиотикотерапии.
В настоящее время для оценки чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам применяют фенотипические методы, которые предполагают оценку влияния веществ на жизнедеятельность микроорганизмов по таким параметрам, как скорость роста и биохимическая активность. Существенными недостатками данных методов является длительность и трудоемкость проводимых манипуляций, что способствует отдалению процесса подбора подходящей
антибиотикотерапии и применения её на практике (Ekadashi R Sabharwal, 2012). Следственно, вопрос наиболее быстрого определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам становится очень важным.
На сегодняшний день современные молекулярно-генетические методы создают новые возможности в области диагностики онкологических заболеваний, пренатальной диагностики моногенных болезней, в судебной медицине для идентификации личности, а также для диагностики инфекционных заболеваний. Представляется возможным использование данных методов для определения противомикробной активности новых химических соединений. В качестве такого метода можно рассматривать полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и её модификации. Метод ПЦР считается одним из наиболее быстрых и точных методов диагностики многих инфекционных заболеваний. Все более часто используется ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (РТ-ПЦР), которая позволяет проводить не только качественный анализ образца на предмет наличия или отсутствия генетической мишени, но и осуществлять количественную оценку содержания целевого маркера в пробе (Saha, 2001). В отличие от традиционных микробиологических методов, метод ПЦР может позволить проводить идентификацию генетических детерминант резистентности микроорганизмов, получать полную антибиотикограмму в короткие сроки, прогнозировать появление устойчивости к различным группам антимикробных препаратов, а также оценивать распространение резистентных штаммов на локальном и региональном уровнях (Парфенова с соавт. 2013). Именно поэтому обнаружение антибиотикорезистентности методом ПЦР является отличным дополнением к традиционному микробиологическому тестированию (Струкова, 2012).
Поиск новых антибактериальных веществ в настоящее время остаётся актуальной задачей в связи с постоянным появлением резистентных к классическим антибиотикам штаммов условно-патогенных
микроорганизмов. Важным направлением такого поиска является исследование антибактериальных свойств новых синтезированных веществ в отношении микроорганизмов, способных вызывать серьезные инфекции. К таким микроорганизмам относится вид Pseudomonas aeruginosa. Этот микроорганизм отличается уникальной способностью быстро приобретать и накапливать устойчивость к антибактериальным препаратам разнообразных групп. Приобретенная устойчивость может быть связана практически со всеми известными механизмами: дерепрессией
хромосомных цефалоспориназ AmpC, продукцией плазмидных или интегрон-опосредованных 0-лактамаз различных молекулярных классов,
снижением мембранной проницаемости в результате утраты пориновых белков OprD, активацией эффлюксных систем с широким субстратным профилем (MexAB-OprM, MexEF-OprN, MexXY-OprM), синтезом аминогликозид-модифицирующих ферментов, структурными
перестройками топоизомераз II и IV (Johansen, 2008; Strateva, 2009). Широкое распространение полиантибиотикорезистентных штаммов Pseudomonas aeruginosa представляет собой глобальную проблему. Поэтому предлагаемая идея определения антимикробных свойств новых химических соединений с использованием ПЦР представляется достаточно востребованной, а проблема весь актуальной.
Цель исследования. Разработка способа ускоренной молекулярно¬генетической оценки противомикробной активности новых химических соединений на модели Pseudomonas aeruginosa.
Задачи исследования
1. Конструирование калибровочного образца pAL-TAPseudAer16S известной концентрации для количественной оценки антимикробной активности антибиотиков в отношении Pseudomonas aeruginosa с помощью метода ПЦР в режиме реального времени.
2. Экспериментальная оценка сконструированного калибратора на антибактериальных препаратах (не менее 5).
3. Разработка системы интерпретации результатов молекулярно-генетического анализа антибактериальной активности препаратов.
4. Тестирование при помощи предложенной технологии новых химических соединений и субстанций, обладающих антимикробным действием.
Практическая значимость. Сконструирован калибровочный образец pAL-TAPseudAer16S для количественной оценки
противомикробной активности химических соединений в отношении условно-патогенных микроорганизмов с помощью метода ПЦР в режиме реального времени.
Область применения результатов исследования. Проведение комплексной оценки противомикробной активности новых химических соединений с помощью метода ПЦР в режиме реального времени может ускорить процесс лечения инфекционных заболеваний благодаря подбору наиболее эффективного препарата в короткие сроки.

Купить