Список сокращений и условных обозначений 3
ВВЕДЕНИЕ 4
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6
1.1. Бактерии рода Bifidobacterium 6
1.2. Пробиотики на основе Bifidobacterium spp. 15
1.3. Бактериофаги 23
1.4. Практическое применение бактериофагов 27
1.5. Пиобактериофаги 32
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 36
2.1. Взятие материала 36
2.2. Пиобактериофаг 37
2.3. Питательные среды 37
2.4. Посев бактерий в жидкую и плотную среды 40
2.5. Создание анаэробных условий 42
2.6. Окраска по Граму 43
2.7. Определение антагонистической активности методом
перпендикулярных штрихов 44
2.8. Титрование фага методом агаровых слоев 45
2.9. Выделение ДНК 46
2.10. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени 48
2.11. Ранговая статистика 50
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 52
3.1. Активность бактериофага по отношению к чистой культуре 52
3.2. Активность бактериофага в клиническом материале 61
3.3. Получение антагонистически активных штаммов 71
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 89
ВЫВОДЫ 90
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 91
ПРИЛОЖЕНИЕ 101
Актуальность
В настоящее время для профилактики и лечения дисбактериоза желудочно-кишечного тракта широко применяются пробиотики (Червинец Ю.В. и др., 2016). Наиболее перспективными среди них являются бактерии рода Bifidobacterium, которые обладают высокой биологической и функциональной активностью. В этой связи они используются на практике как в качестве пробиотиков, так и в производстве пищевых продуктов (Chen C.C., Walker W.A., 2005). Биологическая активность пробиотиков может снижаться, поэтому периодически встает необходимость их проверки и поиска новых штаммов-кандидатов в пробиотики. Важное значение для селекции перспективных пробиотиков имеет экспериментальная оценка их антагонистической активности с помощью бактериофагов.
В наше время фаги применяются в качестве диагностических препаратов для установления рода и вида бактерий, а также в качестве селективных агентов.
В связи с недостаточной оснащенностью лабораторий выращивание Bifidobacterium spp. под питательной средой затруднено, что не дает возможность идентифицировать этот микроорганизм до вида.
Одним из наиболее надежных способов идентификации штаммов Bifidobacterium можно считать полимеразную цепную реакцию.
Цель исследования
Получение при использовании бактериофагов аутоштаммов Bifidobacterium spp. с выраженной антагонистической активностью для создания новых пробиотических препаратов, направленных на коррекцию и поддержание микробиоценоза кишечника.
Задачи исследования
1. Получение чистой культуры штамма Bifidobacterium
2. Приготовление десятикратных разведений клинического материала для определения исходной концентрации бактерий рода Bifidobacterium.
3. Посев клинического материала для получения накопительной культуры.
4. Титрование фага методом агаровых слоев.
5. Выделение изолированных колоний Bifidobacterium spp. и проведение их анализа методом ПЦР с помощью родоспецифичных и видоспецифичных праймеров.
6. Определение антагонистической активности Bifidobacterium spp. и условно-патогенных микроорганизмов методом перпендикулярных штрихов.
Научная новизна
Разработана методика выделения клинических культур бактерий рода Bifidobacterium на питательной среде с Пиобактериофагом, который обеспечивает селективные свойства питательной среды. Сформирована коллекция из 5 штаммов Bifidobacterium spp., выделенных из клинического материала; 3 из которых обладают высокой антагонистической активностью.
Практическая значимость
Из кишечника здоровых людей выделены и исследованы штаммы рода Bifidobacterium, которые могут быть использованы в качестве основы для создания новых пробиотических препаратов и коррекции дисбиотических нарушений микрофлоры.
В работе исследовали влияние бактериофага на рост Bifidobacterium spp. Для этого анализ проводили на жидкой и плотной питательной средах «Бифидум-среда» с добавлением Пиобактериофага поливалентного очищенного и без. По окончанию исследования было выявлено, что Пиобактериофаг не влияет и не подавляет рост Bifidobacterium spp. в обоих средах.
Проводили проверку наличия роста бактерий на ГРМ-бульоне и Бифидум-среде с добавлением Пиобактериофага поливалентного очищенного и без. Произошло подавление роста условно-патогенных микроорганизмов на указанных средах. По результатам проверки была получена модифицированная среда для Bifidobacterium spp. c Пиобактерифагом, которая имеет преимущество, так как на ней подавляется рост некоторых УПМ. Таким образом, были повышены селективные и ингибирующие свойства питательной среды.
Осуществляли получение антагонистически активных штаммов путем подсева накопительной культуры, выделения ДНК и постановки ПЦР в режиме реального времени. Производили посев Bifidobacterium spp. и условно-патогенных микроорганизмов методом перпендикулярных штрихов. В качестве статистической обработки была использована ранговая статистика.
В результате проведенных исследований было установлено, что все исследуемые бактерии рода Bifidobacterium по силе воздействия обладали различной активностью по отношению к условно-патогенным микроорганизмам.
