ПОИСК ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ВИДОВ-ДВОЙНИКОВ СИБИРСКОГО И ПРИМОРСКОГО УГЛОЗУБОВ

АННОТАЦИЯ 3
ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, СОКРАЩЕНИЙ, ТЕРМИНОВ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
1 Обзор литературы 7
1.1 Проблема видообразования и концепции вида 7
1.2 Пути видообразования и гибридизация 8
1.3 Проблема криптических видов (видов-двойников) и способы их обнаружения 10
1.4 Общая характеристика и систематика рода Salamandrella 11
1.5 Молекулярная филогенетика углозубов 12
1.6 Систематическое положение и биология сибирского углозуба 14
1.7 Систематическое положение и биология приморского углозуба 16
1.8 Морфологические и экологические признаки, важные для диагностики видов сибирского и
приморского углозубов 18
1.9 Анализ кариотипов представителей рода Salamandrella 19
1.10 Молекулярно-генетические маркеры, позволяющие дифференцировать углозубов рода
Salamandrella на два вида 20
2 Материалы и методы исследования 22
2.1 Материалы 22
2.2 Получение хромосомных препаратов 22
2.3 Выделение ДНК 23
2.4 Амплификация фрагментов 18S и 5S рДНК 23
2.5 Приготовление ДНК-зонда 18S рДНК 24
2.6 FISH 18S рДНК с метафазными хромосомами Salamandrella tridactyla 25
2.7 Разработка праймеров для ПЦР фрагмента ITS2 видов рода Salamandrella 25
2.8 ПЦР фрагмента ITS2 25
2.9 Апробация тест-системы на основе ПЦР-ПДРФ гена яДНК RAG2 для экспресс-диагностики
видов рода Salamandrella и их возможных гибридов 26
3 Результаты и обсуждение 28
3.1 Получение хромосомных препаратов 28
3.2 Выделение ДНК 28
3.3 Амплификация фрагментов 18S и 5S рДНК 29
3.4 Определение локализации 18S рДНК в кариотипе Salamandrella tridactyla с помощью
FISH 30
3.5 Разработка праймеров для ПЦР фрагмента ITS2 видов рода Salamandrella 33
3.6 ПЦР фрагмента ITS2 33
3.7 Апробация тест-системы на основе ПЦР-ПДРФ гена яДНК RAG2 для экспресс-диагностики
видов рода Salamandrella и их возможных гибридов 34
ВЫВОДЫ 36
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ И ЛИТЕРАТУРЫ 37
Купить

Проблема вида и видообразования в настоящее время остаётся актуальной. Выдвижение различных концепций вида имеет не только теоретическое значение, но и влияет на развитие систематики, а через нее - и на те области биологии, которые опираются на её данные (О криптических видах ..., 2004).
Открытие криптических видов, которые морфологически схожи, но репродуктивно изолированы и явления гибридизации сильно повлияло на формирование концепций вида и видообразования. Появление цитогенетических и молекулярных методов упростило обнаружение данных явлений (Генетическая структура популяций ..., 2009; Боркин, Литвинчук, 2013).
Для изучения криптического видообразования интерес представляют хвостатые земноводные рода Salamandrella (сем. Hynobiidae), имеющие, как в настоящее время считается, парапатрическое распространение (Ареал и генетический полиморфизм углозуба Шренка ..., 2009; Поярков, 2010). Долгое время этот род считался
монотипическим и включал только сибирского углозуба, S. keyserlingii Dybowski, 1870. На основе изменчивости нуклеотидных последовательностей гена цитохрома b (cytb) мтДНК был выделен криптический вид S. schrenckii Strauch, 1870 (Внутривидовая генетическая дифференциация ..., 2005; Ареал и генетический полиморфизм углозуба Шренка ..., 2009). Данное название в настоящее время признаётся невалидным, правомерным считается использование названия S. tridactyla Nikolsky, 1905 (Кузьмин, 2012). Позже выявлены зоны возможной естественной гибридизации между видами (Ареал и генетический полиморфизм углозуба Шренка ., 2009) и показано отсутствие
презиготических барьеров между ними (Ярцев, Куранова, 2013). Морфологических признаков для идентификации видов углозубов недостаточно, цитогенетические исследования рода Salamandrella проводились, когда он считался монотипическим (Makino,1932; Inukai, Okada, 1933; Grafodatsky et al., 1978; Morescalchi et al., 1979; Wang et al., 1983; Kuro-o, 1986; Cytogenetic studies of Hynobiidae ..., 1990a; Molecular cytogenetics of the ribosomal ..., 1993; Zeng et al., 1997), а методы диагностики, основанные в настоящее время в основном на секвенировании мтДНК (Внутривидовая генетическая дифференциация ..., 2005; Поярков, Кузьмин, 2008; Генетическая структура популяций ..., 2009; Поярков, 2010; Полиморфизм гена цитохрома b ..., 2011), не позволяют выявлять межвидовых гибридов.
В связи с этим актуальным является вопрос об особенностях кариотипов данных видов и поиск маркеров для определения видов и их возможных гибридов.
Целью выпускной квалификационной работы является поиск цитогенетических и молекулярно-генетических маркеров для определения видовой принадлежности криптических видов сибирского углозуба, Salamandrella keyserlingii и приморского углозуба, S. tridactyla.
Задачи:
1. Получить препараты метафазных хромосом Salamandrella keyserlingii и S. tridactyla.
2. Синтезировать флуоресцентно меченые ДНК-зонды 18S и 5S рДНК и определить их локализации на хромосомах S. keyserlingii и S. tridactyla с помощью FISH.
3. Разработать праймеры для определения последовательности внутреннего транскрибируемого спейсера ITS2 S. keyserlingii и S. tridactyla.
4. Подобрать условия для ПЦР фрагмента гена RAG2 и провести апробацию тест-системы на основе ПЦР-ПДРФ для определения S. keyserlingii и S. tridactyla и их гибридов.
Объектами исследования являются углозубы Salamandrella keyserlingii и S. tridactyla. Предмет исследования - кариотипы и нуклеотидные последовательности генов яДНК и рДНК двух видов рода Salamandrella.
Работа проводилась в лаборатории экологии, генетики и охраны окружающей среды Томского государственного университета под руководством канд. биол. наук, доцента Г. Н. Артемова, в лаборатории кафедры зоологии позвоночных и экологии Томского государственного университета под руководством канд. биол. наук, доцента В. В. Ярцева и в лаборатории стабильности хромосом и микроэволюции генома Института цитологии РАН (г. Санкт-Петербург) под руководством канд. биол. наук, ст. науч. сотр. Д. В. Скоринова.
Автор работы выражает благодарность канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаборатории териологии ФЦН Биоразнообразия наземной биоты Восточной Азии ДВО РАН (г. Владивосток) И. В. Масловой за предоставление 10 особей S. tridactyla с юга Дальнего Востока (Приморье), сотрудникам лаборатории стабильности хромосом и микроэволюции генома Института цитологии РАН (г. Санкт-Петербург) за консультации и помощь в приготовлении препаратов метафазных хромосом и студентам кафедры зоологии позвоночных и экологии Томского государственного университета за помощь по уходу за животными и первичную камеральную обработку материала.

Купить