ИЗУЧЕНИЕ ГРУППЫ ГЕНОВ ГВАЯКОЛ-ЗАВИСИМЫХ ПЕРОКСИДАЗ У ПШЕНИЦЫ TRITICUM. AESTIVUML. ДЛЯ ОЦЕНКИ ИХ ЭКСПРЕССИИ В ТКАНЯХ, ОБРАБОТАННЫХ РИЗОСФЕРНЫМИ БАКТЕРИЯМИ PSEUDOMONAS EXTREMORIENTALIS PHS1

АННОТАЦИЯ 3
Введение 5
1 Обзор литературы 7
1.1 Антиоксидантная система растений 7
1.2 Пероксидазы 10
1.3 Кристаллическая структура молекул гемовых пероксидаз в связи с их ферментативной
активностью 11
1.4 Различия трех классов растительных гем-пероксидаз 17
1.5 Пероксидазы класса III 19
1.5.1 Механизм пероксидаз класса III, участвующий в поддержании уровня АФК внутри
клетке 22
1.5.2 Структура и локализация пероксидаз класса III 22
1.6 Ризобактериальная системная резистентность 23
2 Материалы и методы 25
2.1 Выращивание растений T. aestivum L 25
2.2 Выделение геномной ДНК из тканей T. aestivum L 27
2.3 Разработка праймеров к экзонам генов гваякол-зависимых пероксидаз класса III T.
aestivum L 27
2.4 Нахождение условий для проведения ПЦР в реальном времени 28
2.5 Методика оценки поражённости растений возбудителями корневой гнили у групп
растений T. aestivum L 29
2.6 Методика определения общей активности гваякол-зависимой пероксидазы в листьях
растений T. aestivum L 31
2.7 Статистическая обработка полученных данных 32
2.8 Выделение тотальной РНК из листьев растений T. aestivum L. c использованием
экстракционного буфера на основе реагента «TRIzol™» (Invitrogen, США) 32
2.9 Электрофорез РНК в агарозном геле 33
2.10 Очистка экстрагированной РНК из листьев T. aestivum L. с помощью реагента
ДНКазы I 34
2.11 Синтез кДНК на матричной РНК 34
2.12 Постановка ПЦР в реальном времени 34
3 Результаты и обсуждения 37
Выводы 49
Список использованных источников и литературы 50
Приложение А
Купить

Растения, являющиеся основой сельскохозяйственных экосистем, находятся в тесной взаимосвязи с микроорганизмами, населяющими подземные и надземные вегетативные органы, и семена. С одной стороны, они подвергаются постоянным атакам насекомых-фитофагов и фитопатогенных микроорганизмов, а с другой, тесные симбиотические связи с ассоциативными ризосферными микроорганизмами за миллионы лет совместной эволюции привели к формированию ряда механизмов, обуславливающих резистентность растений к фитопатогенам как за счет прямого выделения метаболитов полезной микрофлорой, так и за счет формирования невосприимчивости или быстрого ответа в растительных тканях на проникновение патогена [Искусственные ассоциативные симбиозы между томатом и ризобиями, обладающими фунгистатической активностью ..., 2015]. Формирование устойчивости растений связано с работой ферментных систем. Известно, что большое значение в реакциях окислительного взрыва и в индукции системной резистентности растений к фитопатогенам имеют пероксидазы. Установлено, что более высокая пероксидазная активность свойственна устойчивым сортам, а также активность пероксидазы коррелирует с развитием устойчивости растений к абиотическим и биотическим стрессам.
Полезные для растений ризосферные микроорганизмы находят все большее применение в сельскохозяйственной практике, в виде действующего вещества целого ряда биопрепаратов, присутствующих на рынке РФ и широко использующихся за рубежом [Агроэкологическая эффективность биопрепарата экстрасол при выращивании ..., 2017]. Очевидно, что знание механизмов индукции системной резистентности растений бактериями позволит значительно увеличить эффективность использования биологических средств защиты растений или разработать механизмы влияния на данное свойство. Несмотря на то, что отдельные свойства ризобактерий признаны весьма перспективными для продовольственной безопасности РФ и всего мира, основные механизмы, обеспечивающие устойчивый положительный результат при их применении, на настоящий момент остаются не до конца ясными и изученными.
Новые перспективные для биотехнологии штаммы бактерий уже были исследованы на способность активировать ферментные системы растений, в частности, активность свободных и слабосвязанных гваякол-зависимых пероксидаз, относящихся к третьему классу, что опубликовано в ряде работ [Минаева и др., 2018]. На современном этапе развития биотехнологии интерес представляет подтверждение возможности развития у растений ризобактериальной системной резистентности к фитопатогенам, которая связана не только с непосредственным уровнем ферментной активности, сколько с увеличением уровня экспрессии генов в растительной ткани при инокуляции сельскохозяйственных культур полезными штаммами.
Для подтверждения наличия у бактериальных штаммов P. extremorientalis PhS1 способности формировать ризобактериальную системную резистентность путем анализа уровня экспрессии генов, необходимо определить количество матричной РНК для бактеризированных и небактеризированных растений T. aestivum L. и изучить корреляцию между ферментной активностью этих групп и количеством их матричной РНК. При положительной корреляции можно использовать систему оценки экспрессии группы генов гваякол-зависимых пероксидаз для подтверждения возникновения системной резистентности растений через ризобактериальную системную прививку.
Целью данной работы является разработка метода оценки уровня экспрессии генов гваякол-зависимых пероксидаз T. aestivum L. путём получения данных об активности синтеза мРНК у бактеризированных ризосферными микроорганизмами P. extremorientalis PhS1 и небактеризированных растений T. aestivum L.U сопоставление уровня ферментной активности гваякол-зависимых пероксидаз с их генной экспрессией для подтверждения наличия ризобактериальной системной резистентности у пшеницы.
Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи:
1. Подбор праймеров и условий ПЦР для генов гваякол-зависимых пероксидаз класса III группы TaPrx112 T. aestivum L.
2. Определение активности гваякол-зависимых пероксидаз класса III у бактеризованных ризосферными микроорганизмами P. extremorientalis PhS1 и небактеризованных растений T. aestivum L.
3. Определение уровня экспрессии генов группы TaPrx112 гваякол-зависимых пероксидаз класса III у бактеризованных ризосферными микроорганизмами P. extremorientalis PhS1 и небактеризованных растений T. aestivum L.
Купить